廖惠云，吳 洋，馬夢婕，毛淑蕊，朱懷遠，陳晶波*，張 華，曹 毅，朱龍杰，袁益來

（江蘇中煙工業(yè)有限責任公司，江蘇 南京 210019）

近年來，非營養(yǎng)性合成甜味劑的消費增加已成為全球趨勢[1]。為改進食品口味和食用性質，食品包裝紙常會施加人類喜好的甜味劑[2-3]。我國食品添加劑相關標準允許使用十余種合成甜味劑，并對其在不同基質食品中的使用量進行了限定[4]。合理使用人工合成食品甜味劑是安全的，不會對食用者的健康產生風險。但如果超限量、超范圍，或者使用劣質的人工合成食品甜味劑，則會對消費者的身體健康產生負面影響[5-7]。因此，建立一種具有高通量、高準確度、高靈敏度的甜味劑檢測方法，加強監(jiān)測紙質食品包裝材料中甜味劑的應用情況就顯得尤為必要。

目前，對于甜味劑的測定主要集中于飲料、白酒、乳制品等食品基質[8-9]。分析方法分別有液相色譜法[10-11]、離子色譜法[12-14]、毛細管電泳法[15-17]、氣相色譜法[18-21]等，主要以液相色譜法為主。由于不同甜味劑的物理化學性質、電化學性質和光譜性質存在顯著差異，液相色譜法很難滿足多種甜味劑同時檢測要求，離子色譜法、毛細管電泳法等也由于靈敏度低等原因應用不多。隨著各國對甜味劑使用要求越來越嚴格，使得開發(fā)更為簡單快速、靈敏度高的檢測方法成為必要。由于液相色譜-串聯質譜技術具有檢測通量大、準確、靈敏的特點，被廣泛用于食品領域的檢測，運用該技術同時分析多種甜味劑已經成為一種趨勢[22-27]。然而，在分析基質復雜樣品時，樣品本身所帶來的基質效應給質譜分析帶來一定挑戰(zhàn)，必須采用適當的措施降低或消除樣品基質效應，以確保分析結果的可靠性及準確性。

考慮到現代食品工業(yè)對甜味劑的使用都以多種復配的形式添加。因此，在參考相關研究基礎上[28-29]，基于優(yōu)選樣品前處理方式和目標物檢測效率考慮，創(chuàng)新采用基質匹配溶劑標準曲線定量，使用高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）儀同時測定干性食品包裝紙中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、新橙皮苷二氫查爾酮、紐甜、甜菊糖苷8 種甜味劑的含量。該方法基本上排除了基質效應的影響，具有簡單、快捷、準確可靠的特點。在確保檢測結果質量的同時，也在很大程度上提高了檢測效率，適用于干性食品包裝紙中甜味劑的監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

包裝材料用原紙由高郵衛(wèi)星卷煙材料有限公司提供；市售不同品牌共10 個不同規(guī)格糖果、巧克力用干性食品包裝紙。

甲醇、乙腈（均為HPLC級） 美國Tedia公司；甲酸、三乙胺（均為色譜純）、乙酸銨（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；安賽蜜（CAS號為33665-90-6）、糖精鈉（CAS號為128-44-9）、甜蜜素（CAS號為139-05-9）、三氯蔗糖（CAS號為56038-13-2）、阿斯巴甜（CAS號為22839-47-0）、新橙皮苷二氫查爾酮（CAS號為20702-77-6）、紐甜（CAS號為165450-17-9）及甜菊糖苷（CAS號為57817-89-7）均為標準品，含量≥98.0%，分別購自美國Aladdin公司、美國Sigma-Aldrich公司和北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1260/6460 高效液相色譜-三重四極桿質譜儀（配備電噴霧電離源） 美國Agilent公司；KQ-500DE超聲波發(fā)生器 昆山市超聲儀器有限公司；TDZ4A-WS離心機 湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；T201電子天平（感量0.000 1 g） 瑞士Mettler-Toledo公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準工作溶液配制

1.3.1.1 基質匹配溶劑

取包裝材料用原紙，準確裁取面積為4 cm×4 cm試樣，將其剪碎成約1 mm×1 mm大小紙片，并全部轉移至50 mL具塞錐形瓶中，準確加入10 mL甲酸-三乙胺緩沖溶液（pH 4.5），于60%功率條件下超聲萃取45 min，結束后搖勻，靜置片刻，經0.22 μm水相濾膜過濾，得基質匹配溶劑。

1.3.1.2 標準工作溶液

分別準確稱取40 mg安賽蜜、50 mg糖精鈉、30 mg甜蜜素、60 mg三氯蔗糖、40 mg阿斯巴甜、20 mg新橙皮苷二氫查爾酮、10 mg紐甜、30 mg甜菊糖苷（精確至0.1 mg），轉移至100 mL容量瓶中，用基質匹配溶劑稀釋并定容至刻度，混勻，制得8 種甜味劑混合標準儲備液。再分別準確移取標準儲備液10、25、50、250、500 μL和1 000 μL，用基質匹配溶劑稀釋定容至10 mL容量瓶中，配制得到6級標準工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

將0.8 mL甲酸加入1 L水中，然后在攪拌的狀態(tài)下用約2.5 mL三乙胺調pH值至4.5，配制成三乙胺緩沖溶液。然后，取干性食品包裝用紙，裁取面積為4 cm×4 cm試樣，并準確稱其質量（精確至0.1 mg），將其剪碎成約1 mm×1 mm大小紙片，并全部轉移至50 mL具塞錐形瓶中，準確加入10 mL三乙胺緩沖溶液，浸潤1 h，然后于60%功率條件下超聲萃取45 min，結束后搖勻，試樣溶液4 000 r/min離心5 min，靜置片刻，取上層清液得樣品進樣液，待上機分析。

1.3.3 儀器分析

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.4 mL/min：流動相：A相為甲醇，B相為5 mmol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫程序：0～8 min為30% A和70% B，8.1～30 min為60% A和40% B，30.1～35 min為80% A和20% B，35.1～40 min為30% A和70% B。離子源：電噴霧離子源；離子源溫度：100 ℃；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流量：9 L/min；霧化氣壓力：275.79 kPa；毛細管電壓：正離子為4 000 V，負離子為3 500 V；檢測方式：多反應監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優(yōu)化

取高濃度混合標準溶液，在電噴霧離子源正負離子模式下進行質譜全掃描檢測，得出被測化合物一級質譜圖，結果顯示：阿斯巴甜[M+H]+和紐甜[M+H]+在正離子模式豐度較高，而安賽蜜[M－K]－、糖精鈉[M－Na－2H2O]－、甜蜜素[M－Na]－、三氯蔗糖[M－2H]－、新橙皮苷二氫查爾酮[M－H]－、甜菊糖苷[M－H]－在負離子模式豐度較高，選擇每個化合物豐度最高的特征離子為其對應的母離子。在優(yōu)選的離子模式下對各化合物進行選擇離子掃描，對裂解電壓進行優(yōu)化。得到合適的裂解電壓后，進行二級質譜掃描確定其子離子，選取兩組特征離子作為定量和定性子離子，其中安賽蜜、甜蜜素、三氯蔗糖、新橙皮苷二氫查爾酮和甜菊糖苷裂解時得到的碎片離子較少，依據豐度較強、信號穩(wěn)定的原則，分別選擇m/z162、177、94.3、610.7、802為其定性子離子。最后分別進行碰撞能量優(yōu)化，得到安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、新橙皮苷二氫查爾酮、紐甜、甜菊糖苷8 種甜味劑的較佳質譜參數，如表1所示。

表1 8 種甜味劑的MRM參數Table 1 MRM MS parameters for eight sweeteners

2.2 色譜條件優(yōu)化

一般來說，反相色譜的流動相常由水和有機溶劑（如甲醇、乙腈）等組成，由于部分被測物質極性較強，流動相的洗脫能力剛開始不宜過強，同時待分離的8 種甜味劑有些極性相近，保留時間相近，采用乙腈為有機相時易導致個別組分共流出情況較甲醇嚴重，而甲醇可使8 種甜味劑保留時間相對延遲，同時考慮到各目標物的峰面積響應相差不大，且乙腈的毒性較甲醇大，故選擇甲醇為實驗的有機相。進一步，由于流動相要進入質譜儀，添加一定量的緩沖溶液可以增加響應值，所以考慮甲醇-水溶液、甲醇-乙酸銨溶液、甲醇-甲酸溶液3 種流動相體系。以目標物在色譜柱上的分離度、峰形、靈敏度等為考察指標，對3 種流動相體系進行比較。結果表明，體系中添加乙酸銨，不僅更有利于目標物在色譜柱上的保留，而且能夠提高部分物質的電離化程度，增加信號響應，從各目標物分離度、峰形、響應值以及保留時間的穩(wěn)定性等指標進行綜合衡量，甲醇-乙酸銨溶液作為流動相時（圖1），各目標物色譜峰出峰情況良好，色譜峰峰形、響應強度以及分離效果總體上優(yōu)于其余兩種流動相。因此，本研究為了避免較高濃度的緩沖鹽體系對質譜的影響，在滿足要求的情況下選用甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液為流動相進行梯度洗脫。

圖1 MRM模式下種8 種甜味劑總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of eight sweeteners under MRM mode

2.3 樣品前處理優(yōu)化

綜合考慮8 種甜味劑的理化性質，可知阿斯巴甜、紐甜等二肽類化合物一般在pH 3～5環(huán)境下較為穩(wěn)定[9]，因此以食品包裝紙樣品對象，添加一定量的混合標準溶液，考察純水和三乙胺緩沖溶液作為溶劑對目標物萃取效率的影響，結果見表2?？梢钥闯?，樣品溶液中大部分甜味物質檢測結果較為一致，唯有阿斯巴甜的檢測結果分別為1.55 μg/mL和1.87 μg/mL，兩者相差較大。這可能與目標物所處的環(huán)境有關，即阿斯巴甜主要是由天冬氨酸和苯丙氨酸合成的二肽類物質，對酸堿穩(wěn)定性相比于紐甜稍差，且溫度高于80 ℃時不穩(wěn)定，然而樣品前處理采用超聲萃取，隨著萃取時間延長，水浴溫度逐漸升高，進而對目標物的量化結果產生一定影響。為此，選用三乙胺緩沖溶液為樣品萃取溶劑。

表2 不同溶劑對8 種甜味劑的檢測效果（n=3）Table 2Effect of solvents on the results of determination of eight sweeteners (n= 3)

2.4 基質效應評估

基質效應普遍存在于HPLC-MS/MS檢測中，表現為離子增強或離子抑制，從而導致定量結果有一定的偏差。為了考察本方法在去除基質效應方面的效果，按照Matuszewski等[30]報道的方法對其進行基質效應評估。按照1.3.1節(jié)所述，以不含目標物的包裝材料用原紙為樣品對象進行處理，制得基質匹配溶劑，再配制混合標準工作溶液。此外，用超純水配制同樣質量濃度的混合標準溶液。最后用HPLC-MS/MS分別分析以上2 種混合標準溶液。按照公式“基質效應/%=（基質標準溶液峰面積/溶劑標準溶液峰面積）×100”計算基質效應，其中，基質效應大于100%時為基質增強效應，小于100%時為基質抑制效應。不同質量濃度條件下8 種甜味劑在食品紙張樣品中的基質效應見圖2?？梢钥闯?，安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、紐甜5 種甜味劑的基質效應均在95%～105%之間，說明基質效應較弱；阿斯巴甜平均基質效應為92.34%，其中較低值為87.36%，說明存在一定的基質抑制效應，而新橙皮苷二氫查爾酮和甜菊糖苷平均基質效應分別為107.03%和105.38%，其中較高值分別為116.39%和108.75%，說明存在一定的基質增強效應。因此，采用基質匹配溶劑配制標準工作溶液消除和（或）補償基質效應給定量帶來的偏差。

圖2 8 種甜味劑在紙張樣品中的基質效應Fig.2 Matrix effects of eight sweeteners in paper samples

2.5 方法學驗證

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限及定量限

采用優(yōu)化好的HPLC-MS/MS條件對系列標準工作溶液進行測定，以系列標準工作溶液峰面積為縱坐標，其質量濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線，并進行線性擬合，計算線性回歸方程。采用不含目標物樣品為對象添加標準溶液，經樣品前處理后進樣分析，經逐步稀釋后以各種甜味劑信噪比（RSN）為3時的進樣濃度確定為每種甜味劑的檢出限，以各種甜味劑RSN為10時的進樣濃度確定為定量限。如表3所示，8 種甜味劑在各自的線性范圍內線性關系良好，線性相關系數（R2）均大于0.995，8 種甜味劑的檢出限和定量限分別在0.13～2.50 mg/kg和0.43～8.33 mg/kg之間，可以滿足各物質的定量分析要求。

表3 8 種甜味劑的回歸方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量限Table 3Calibration curve equations, linear ranges, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification for eight sweeteners

2.5.2 方法的準確度和精密度

以巧克力包裝紙樣品對象，通過加標樣品的回收率實驗驗證該方法的準確度，并以相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）考察精密度。參照相關標準檢測方法確認的回收率和精密度測試要求[31]，在低、中、高3 個加標水平（LOQ、2 倍LOQ、10 倍LOQ）下進行回收率實驗，每個濃度水平重復測定6 次，計算樣品中各種甜味劑的回收率和RSD，結果見表4。8 種甜味劑加標回收率在85.49%～108.81%之間，RSD在2.24%～6.03%之間，表明方法具有較好的準確度和重復性，能夠滿足微量目標物的定量分析。

表4 不同加標樣品的回收率和RSD（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of eight sweeteners at different spiked concentrations (n= 6)

2.6 實際樣品的測定結果

采用本方法，對市售不同品牌共10 個不同規(guī)格糖果、巧克力用干性食品包裝紙進行檢測分析，結果（圖3）顯示有1 個樣品中檢測出含有1#安賽蜜和7#紐甜，含量分別為0.56 g/kg和0.015 g/kg。對比GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中有關甜味劑的使用要求，安賽蜜在不同基質食品中的最大使用量介于0.3～4.0 g/kg之間（其中糖果類為2.0 g/kg），紐甜在不同基質食品中的最大使用量介于0.01～1.0 g/kg之間（其中干性食品中都在0.02 g/kg以上），可知抽檢樣品結果滿足標準限量使用要求。

圖3 典型食品包裝紙?zhí)鹞秳z測總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatogram of typical sweeteners in food wrappings

3 結 論

本實驗以原紙為對象配制基質匹配溶劑，采用三乙胺緩沖溶液為萃取溶劑對樣品進行超聲提取，優(yōu)化樣品前處理條件及色譜條件參數，對比考察基質效應，建立基質匹配曲線校正-HPLC-MS/MS法同時測定干性食品包裝紙中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、新橙皮苷二氫查爾酮、紐甜、甜菊糖苷8 種甜味劑含量的方法。實際樣品測定結果表明，本方法簡便快捷、靈敏度高，可滿足現行法規(guī)的限量要求，適用于干性食品包裝紙中8 種甜味劑的檢測需求。