薛紀(jì)森　　羅惜紹　　潘一帆　　馬京杭　　吳文烈　胡燕

[摘要] 目的 通過檢測(cè)不同濃度IL-17處理后宮頸癌Caski細(xì)胞與人外周血單核細(xì)胞（PBMC）共培養(yǎng)系統(tǒng)下癌細(xì)胞生長率及凋亡率情況，探討IL-17所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在高危型HPV相關(guān)宮頸癌發(fā)展中的作用。 方法 選取2017年9月至2019年6月期間我院就診的健康女性及部分本院女性志愿者，抽取外周抗凝血10 mL用于提取人外周血單核細(xì)胞（PBMC），與包含高危型HPV序列的宮頸癌Caski細(xì)胞株進(jìn)行共培養(yǎng)，經(jīng)過不同濃度的rhIL-17處理，采用CCK-8法檢測(cè)各組癌細(xì)胞的生長率，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組癌細(xì)胞的凋亡率。 結(jié)果 ①CCK-8法結(jié)果顯示，低濃度組癌細(xì)胞生長率最高，為（125.65±7.28）%，高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;高濃度組癌細(xì)胞生長率為（110.56±9.39）%，同樣高于對(duì)照組，低于低濃度組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;②流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，低濃度組宮頸癌細(xì)胞的凋亡率最低，為（10.67±0.20）%，低于對(duì)照組的（12.43±0.81）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;高濃度組癌細(xì)胞的凋亡率為（11.99±0.11）%，同樣低于對(duì)照組，高于低濃度組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 IL-17 所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與宮頸癌的發(fā)展密切相關(guān)，其在腫瘤發(fā)展的不同階段表現(xiàn)出雙重效應(yīng)，為進(jìn)一步研究高危型HPV相關(guān)宮頸癌的免疫治療措施提供了基本理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 白細(xì)胞介素17;宮頸癌;人乳頭瘤病毒;凋亡

[中圖分類號(hào)] R737.33? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）09-0039-05

Role of IL-17 in the growth and apoptosis of Caski cells in cervical cancer

XUE Jisen1? ?LUO Xishao1? ?PAN Yifan2? ?MA Jinghang1? ?WU Wenlie1? ?HU Yan1

1.Department of Gynecology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325000， China; 2.Department of Anesthesiology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325000， China

[Abstract] Objective To detect the growth rate and apoptosis rate of cancer cells in the co-culture system of Caski cells in cervical cancer and human peripheral blood mononuclear cells （PBMC） treated with different concentrations of IL-17， so as to investigate the function of IL-17 mediated immune reaction in the development of high-risk HPV-related cervical cancer. Methods Healthy women and some female volunteers admitted to our hospital from September 2017 to June 2019 were selected，and 10 mL of peripheral anticoagulant was used to extract human PBMC， which were co-cultured with Caski cell in cervical cancer containing high-risk HPV sequence. After treatment with different concentrations of rhIL-17， the growth rate of each group of cancer cells was detected by CCK-8 method， and the apoptosis rate of each group of cancer cells was detected by flow cytometry. Results （1）CCK-8 method showed that the growth rate of cancer cells in the low concentration group was the highest（125.65±7.28）%，which was higher than that in the control group，with statistically significant difference（P<0.05）; The growth rate of cancer cells in the high concentration group was（110.56±9.39）%， which was also higher than that in the control group，the growth rate of cancer cells in the high concentration group was lower than that in the low concentration group，but without statistically significant difference（P>0.05）. （2）The results of flow cytometry showed that the apoptosis rate of cervical cancer cells in the low concentration group was the lowest（10.67±0.20）%， which was lower than that of（12.43±0.81）% in the control group，with statistically significant difference（P<0.05）; The apoptosis rate of cancer cells in the high concentration group was（11.99±0.11）%，also lower than that in the control group，the apoptosis rate of cervical cancer cells in the high concentration group was higher than that in the low concentration group，but without statistically significant difference（P>0.05）. Conclusion The immune reaction mediated by IL-17 is closely related to the development of cervical cancer，and it shows double effects in different stages of tumor development，which provides a basic theoretical basis for further research of immunotherapy measures for high-risk HPV-related cervical cancer.

[Key words] Interleukin 17; Cervical cancer; Human papillomavirus; Apoptosis

宮頸癌是威脅女性生命健康的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率逐年上升，2018 年世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)顯示[1]，全球每年新發(fā)宮頸癌病例569 800例和死亡病例311 400例，而2015年中國數(shù)據(jù)顯示，婦女每年新發(fā)宮頸癌病例為98 900例，是第二高發(fā)國家[2]。宮頸癌的病因已明確為高危型人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染，但臨床上HPV感染多數(shù)呈一過性，只有10%左右的高危型HPV呈慢性持續(xù)感染狀態(tài)，進(jìn)而引發(fā)宮頸癌[3]。近年來研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素17（Interleukin-17，IL-17）作為輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）分泌的特異性效應(yīng)因子，具有強(qiáng)大的招募、激活中性粒細(xì)胞的功能，是人體針對(duì)外來病原體感染產(chǎn)生免疫應(yīng)答過程中的重要細(xì)胞因子，在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮了重要的作用。前期研究提示IL-17所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與宮頸癌的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)[6-7]。故本研究針對(duì)IL-17在宮頸癌Caski細(xì)胞生長、凋亡中的具體作用，以探討IL-17介導(dǎo)的免疫應(yīng)答與高危型HPV感染相關(guān)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展之間的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月至2019年6月我院就診的健康女性及部分本院女性志愿者共5位，分別抽取外周抗凝血10 mL用于提取PBMC。納入標(biāo)準(zhǔn)：①育齡期健康女性;②非月經(jīng)期;③曾有性生活;④經(jīng)宮頸液基細(xì)胞學(xué)及HPV檢測(cè)無異常者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠、生殖系統(tǒng)或全身其他系統(tǒng)各種急、慢性疾病，包括感染性疾病、免疫性疾病、結(jié)締組織病或惡性腫瘤等者;②近期接受過各種藥物治療者;③術(shù)前四項(xiàng)任何一項(xiàng)陽性者。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本采集前獲得患者知情同意，期間采集所有血液樣本均用于本研究。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器? 細(xì)胞培養(yǎng)主要試劑包括Caski細(xì)胞（上海蓋寧生物科技有限公司），人外周血淋巴分離液（北京索萊寶科技有限公司），人重組白介素17（Recombinant Human IL-17，rhIL-17，novoprotein）、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS，BBI Life Sciences）、磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS）、DMEM（Dulbecco′s modified eagle medium）、MEM（Modified eagle medium）及R1640完全培養(yǎng)基（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）;CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），全自動(dòng)酶標(biāo)（北京六一生物科技有限公司）;流式細(xì)胞術(shù)主要抗體Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司），NovoCyte流式細(xì)胞儀（型號(hào)NovoCyte 2060R，杭州艾森生物有限公司）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)? 人宮頸癌細(xì)胞Caski，加入新鮮配制的培養(yǎng)基DMEM+10%FBS+1%雙抗，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至狀態(tài)良好，經(jīng)胰酶消化后重懸Caski細(xì)胞與PBMC進(jìn)行共培養(yǎng)至48 h，以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 人外周血單核細(xì)胞分離? 每次采集健康女性外周抗凝全血10 mL后立即送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，加入新鮮培養(yǎng)基R1640+10%FBS+1%雙抗，用等體積的PBS稀釋，在離心管中加入適量的分離液，800 g離心30 min后出現(xiàn)分層，小心吸取中間的白膜層至離心管中，加入10 mL的PBS洗滌，250 g離心10 min，棄上清，再次加入5 mL的PBS洗滌，250 g離心10 min后棄上清，加入培養(yǎng)基重懸至瓶中，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中與Caski細(xì)胞進(jìn)行1∶1共培養(yǎng)。

1.2.4 主要試劑配制? rhIL-17用10 mL PBS溶解1 μg粉末得100 000 pg/mL的母液，作用細(xì)胞時(shí)2000倍稀釋加入得終濃度50 pg/mL。后續(xù)Caski細(xì)胞和PBMC以1∶1的比例共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入相應(yīng)濃度的rhIL-17處理，共分為兩組：高濃度組為50 pg/mL，低濃度組為5 pg/mL。以Caski細(xì)胞加PBMC共培養(yǎng)組為對(duì)照組。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)各組癌細(xì)胞的生長率? 將待測(cè)的96孔板細(xì)胞換成相同的培養(yǎng)基，每孔100 μL;每孔加入10 μL CCK8試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h;酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測(cè)每孔的吸光值，將對(duì)照組Caski細(xì)胞的存活率定義為100%，根據(jù)各組吸光值計(jì)算各組Caski細(xì)胞的生長率。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組癌細(xì)胞的凋亡率? 收集（1～3）×106個(gè)細(xì)胞，加1 mL PBS，1500 rpm離心，3 min，洗兩遍;取300 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞;每管各加入3 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI-PE;輕微混勻后，室溫避光孵育10 min;再向每管中加入200 μL預(yù)冷的1×Binding Buffer，混勻后上流式儀檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

①CCK-8法檢測(cè)各組Caski細(xì)胞的吸光度值，與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，評(píng)價(jià)經(jīng)高濃度和低濃度組rhIL-17處理后癌細(xì)胞的生長情況;②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)Annexin V-FITC和PI-PE染色后各組Caski細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算得出Caski細(xì)胞的凋亡百分率，與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，評(píng)價(jià)經(jīng)高濃度和低濃度組rhIL-17處理后癌細(xì)胞的凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad prism7統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及制圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（x±s）表示;正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)后行方差分析，各組間兩兩比較采用Bonferroni法檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rhIL-17不同濃度組和對(duì)照組Caski細(xì)胞的生長率比較

將對(duì)照組Caski細(xì)胞的生長率定義為100.00%，低濃度組Caski細(xì)胞生長率為（125.65±7.28）%，高濃度組Caski細(xì)胞生長率為（110.56±9.39）%。低濃度組Caski細(xì)胞生長率最高，明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;高濃度組Caski細(xì)胞生長率同樣高于對(duì)照組，低于低濃度組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示低濃度組Caski細(xì)胞生長最快，對(duì)照組Caski細(xì)胞生長最慢。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組Caski細(xì)胞凋亡率

2.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的設(shè)閾方法及各組細(xì)胞染色結(jié)果? ?經(jīng)Annexin V-FITC和PI-PE染色后，分別檢測(cè)rhIL-17不同濃度組與對(duì)照組Caski細(xì)胞的凋亡率。

2.2.2 rhIL-17不同濃度組和對(duì)照組Caski細(xì)胞的凋亡率比較? 低濃度組Caski細(xì)胞的凋亡率最低，為（10.67±0.20）%，低于對(duì)照組的（12.43±0.81）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;高濃度組Caski細(xì)胞的凋亡率為（11.99±0.11）%，同樣低于對(duì)照組，高于低濃度組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示低濃度組Caski細(xì)胞凋亡最少，對(duì)照組Caski細(xì)胞凋亡最多。

3 討論

白介素17（Interleukin-17，IL-17）是在20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的一類多效性細(xì)胞因子，可由多種免疫細(xì)胞群分泌產(chǎn)生，其中最主要的是輔助性T細(xì)胞 17（T helper cell 17，Th17）亞群，其參與人體多種生理和病理生理狀態(tài)，包括癌癥、自身免疫性疾病以及感染性疾病的免疫反應(yīng)[8-10]。隨著近年來研究的進(jìn)一步深入，IL-17在許多疾病中的作用已受到廣泛關(guān)注。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-17在各種疾病的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮了重要作用[11-16]。已往多數(shù)研究認(rèn)為，IL-17具有致病作用而不是保護(hù)性作用，最早支持IL-17的促腫瘤作用的是Tartour等[17]的研究，用IL-17培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞在體外未對(duì)癌細(xì)胞增殖產(chǎn)生直接影響，但通過轉(zhuǎn)染IL-17 cDNA的兩株細(xì)胞系后的裸鼠移植瘤體積相比對(duì)照組明顯增大。Alves等[18]也認(rèn)為，Th17及IL-17抑制宿主免疫反應(yīng)，而不是誘導(dǎo)有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致HPV的復(fù)制和持續(xù)感染，促進(jìn)宮頸腫瘤的生長和進(jìn)展。然而部分新的研究表明[19-20]，IL-17同時(shí)具有促進(jìn)腫瘤和保護(hù)腫瘤的雙重功能，在早期腫瘤發(fā)生過程中，IL-17支持腫瘤生長，而在已形成的腫瘤中，IL-17的產(chǎn)生可增強(qiáng)抗腫瘤免疫。

為明確IL-17 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與高危型HPV病毒相關(guān)宮頸癌發(fā)展之間的關(guān)系，本研究采用CCK-8法檢測(cè)宮頸癌Caski細(xì)胞與人外周血單核細(xì)胞（PBMC）共培養(yǎng)時(shí)的生長情況，經(jīng)不同濃度rhIL-17的處理后，結(jié)果顯示，低濃度組的癌細(xì)胞生長最快，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高濃度組的癌細(xì)胞相比對(duì)照組生長快，但較低濃度組生長慢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示宮頸癌細(xì)胞在低濃度IL-17水平時(shí)生長最快，而在濃度升高后癌細(xì)胞生長變慢，可見在腫瘤早期IL-17濃度較低時(shí)表現(xiàn)出促腫瘤作用，而隨著腫瘤的發(fā)展，IL-17濃度升高，可能其促腫瘤效應(yīng)開始下降。

本研究同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)宮頸癌Caski細(xì)胞與人外周血單核細(xì)胞（PBMC）共培養(yǎng)后各組癌細(xì)胞的凋亡情況，經(jīng)不同濃度rhIL-17的處理后，結(jié)果顯示，低濃度組癌細(xì)胞的凋亡率最低，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高濃度組的癌細(xì)胞相比對(duì)照組凋亡率也低，但較低濃度組凋亡率高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示在低濃度IL-17水平時(shí)宮頸癌細(xì)胞凋亡減少，表現(xiàn)出促腫瘤效應(yīng)，而在濃度升高后癌細(xì)胞凋亡開始增加，其促腫瘤效應(yīng)開始下降，與CCK-8法結(jié)果一致。

IL-17 所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與宮頸癌的發(fā)展密切相關(guān)，其在腫瘤發(fā)展的不同階段表現(xiàn)出雙重效應(yīng)，在腫瘤早期表現(xiàn)出促腫瘤作用，而在進(jìn)展期則表現(xiàn)為增強(qiáng)抗腫瘤免疫。因此，IL-17作為目前癌癥研究中很有前景的免疫治療靶點(diǎn)，本研究結(jié)果對(duì)IL-17相關(guān)免疫治療提出挑戰(zhàn)，實(shí)行一刀切的治療方案可能并不理想，為進(jìn)一步研究高危型HPV相關(guān)宮頸癌的免疫治療措施提供了基本理論依據(jù)。

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（收稿日期：2020-11-12）