沈海容 王大東 羅顯克 王保健 吳曉莉 農(nóng)云翠

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧市 530001，電子郵箱：415487460@qq.com)

陷窩蛋白(caveolin，Cav) 是分子量為21～24 kD的多功能信號(hào)蛋白，其家族成員有Cav-1、Cav-2 和Cav-3。研究表明，Cav-1是Cav家族的重要組成部分[1]，是一種高親和力、脂質(zhì)結(jié)合蛋白。Cav-1能被脂多糖、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、氧自由基、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、瘦素等多種因子激活[2]，與細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、炎癥等密切相關(guān)[3-5]。研究表明，Cav-1在許多慢性肝臟疾病，如慢性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌、脂肪肝等肝組織中表達(dá)升高[6]。根據(jù)組織學(xué)酒精性肝病可分為3個(gè)階段，即脂肪肝或單純脂肪變性、酒精性肝炎、慢性肝炎合并肝纖維化或肝硬化。我們推斷Cav-1在酒精性肝病中同樣扮演重要角色。本課題組前期研究表明，紅背葉根對(duì)酒精性肝纖維化大鼠具有保肝、降酶、抗肝纖維化的作用[7-8]，結(jié)合Cav-1在肝臟疾病中所扮演的重要角色，推測(cè)Cav-1 可能是紅背葉根防治酒精性脂肪肝的作用靶點(diǎn)之一。本研究通過乙醇誘導(dǎo)建立酒精性脂肪肝離體細(xì)胞模型，觀察紅背葉根水提物對(duì)乙醇誘導(dǎo)的酒精性脂肪肝細(xì)胞中Cav-1表達(dá)水平的影響，以初步探討紅背葉根對(duì)酒精性脂肪肝的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物紅背葉根 采自廣東省惠州市，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中藥鑒定與藥用植物教研室鑒定為大戟科植物紅背山麻桿的根。紅背葉根水提物提取方法：紅背葉根干燥粉碎后，用蒸餾水溶解，4℃、3 000 r/min離心20 min取上清，60℃水浴消毒3次。

1.2 細(xì)胞株 人胎肝L02細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 試劑及儀器 高糖杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購(gòu)自Gibco公司；小牛血清(56℃、30 min滅活，批號(hào)：180127)購(gòu)自中國(guó)浙江天杭生物科技有限公司；谷氨酰胺、四甲基偶氮唑鹽、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司(批號(hào)：18112001)；青-鏈霉素溶液購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司(批號(hào)：18106101)。寶特ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；Bx60型倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。RNA提取試劑盒TRIzol試劑(批號(hào)：18765032)和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(批號(hào):741023)均購(gòu)自日本TAKARA公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將復(fù)蘇后的L02肝細(xì)胞放入培養(yǎng)瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于濕度95%、5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2 d換液1次，每3～4 d用0.25%胰蛋白酶消化，以1 ∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.4.2 酒精性脂肪肝細(xì)胞模型的建立：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中飽和濕度條件下常規(guī)方法培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度乙醇組，不同濃度乙醇組分別在培養(yǎng)液中加入10 μL/孔的20、40、60、80、100 mmol/L乙醇，對(duì)照組加等體積培養(yǎng)液。處理20 h后，每孔加入20 μL 5g/L四甲基偶氮唑鹽溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μL，震蕩5 min后，在酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=A給藥組/A對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，每組均設(shè)有副孔求取平均值。

1.4.3 紅背葉根水提物對(duì)乙醇損傷后L02 細(xì)胞存活率的影響：將細(xì)胞以每孔5×104個(gè)的密度接種于96孔板，分為空白對(duì)照組和不同濃度紅背葉根組，不同濃度紅背葉根組給予80 mmol/L乙醇干預(yù)24 h后，分別加入不同濃度(12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0 mg/mL)紅背葉根水提物，空白對(duì)照組只加入等體積的DMEM培養(yǎng)液。干預(yù)20 h后，每孔加5 g/L四甲基偶氮唑鹽溶液20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 200 μL，震蕩5 min后，在酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，每組均設(shè)有副孔求取平均值。

1.4.4 紅背葉根水提物對(duì)乙醇損傷后L02 細(xì)胞三酰甘油水平的影響：按照1.4.3方法分組及處理細(xì)胞24 h后，采用不同濃度(3.125、1.56、0.78、0 mg/mL)紅背葉根水提物干預(yù)紅背葉根組L02 細(xì)胞，空白對(duì)照組只加入等體積的DMEM培養(yǎng)液，干預(yù)20 h后收集細(xì)胞，采用細(xì)胞三酰甘油檢測(cè)試劑盒(上海邦景實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：19240021)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)三酰甘油水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，每組均設(shè)有副孔求取平均值。

1.4.5 紅背葉根水提物對(duì)乙醇損傷后L02 細(xì)胞Cav-1 mRNA表達(dá)水平的影響：按照1.4.3方法分組及處理細(xì)胞24 h后，采用不同濃度(3.125、1.56、0.78、0 mg/mL)紅背葉根水提物干預(yù)紅背葉根組L02 細(xì)胞，空白對(duì)照組只加入等體積的DMEM培養(yǎng)液。干預(yù)20 h后收集細(xì)胞，采用TRIzol試劑盒提取L02 細(xì)胞的總RNA，采用紫外分光光度儀測(cè)定A260/A280比值,檢測(cè)RNA純度和濃度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，批號(hào)：741023)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)L02細(xì)胞Cav-1 mRNA的表達(dá)水平。所有引物采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)，由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司合成。Cav-1 mRNA引物上游序列為5′-CGCCATTCTCTCTTTCCTGC-3′，下游序列為 5′-AGACGGTGTGGACGTAGA-3′，β-肌動(dòng)蛋白引物上游序列5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游序列5′CTGCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。反應(yīng)條件為95℃ ，3 min；95℃，5 s；56℃，10 s；72℃，25 s；39 個(gè)循環(huán)；65℃，5 s；95℃，50 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，以Cav-1基因與內(nèi)參基因灰度值的比值作為Cav-1基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度乙醇對(duì)L02 細(xì)胞存活率的影響 與對(duì)照組比較，不同濃度乙醇組，L02細(xì)胞的活性和存活率均下降(均P<0.05)，見表1。乙醇濃度為80 mmol/L時(shí)細(xì)胞存活率在60%左右，因此本研究使用80 mmol/L的乙醇處理L02細(xì)胞建立細(xì)胞模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 對(duì)照組和不同濃度乙醇組LO2細(xì)胞活性和存活率的比較

2.2 不同濃度紅背葉根水提物對(duì)乙醇損傷L02 細(xì)胞存活率的影響 空白對(duì)照組、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL紅背葉根組細(xì)胞活性和存活率均高于0 mg/mL紅背葉根組，6.25 mg/mL、12.5 mg/mL紅背葉根組細(xì)胞活性和存活率均低于0 mg/mL紅背葉根組(均P<0.05)，見表2。本研究選取細(xì)胞存活率大于50%的3個(gè)紅背葉根濃度組(3.125、1.56、0.78mg/mL)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同濃度紅背葉根對(duì)乙醇損傷L02 細(xì)胞存活率的影響

2.3 不同濃度紅背葉根對(duì)乙醇損傷L02 細(xì)胞三酰甘油水平的影響 與空白對(duì)照組比較，不同濃度紅背葉根組三酰甘油水平均升高，且0 mg/mL、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL、3.125 mg/mL紅背葉根組三酰甘油水平依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 不同濃度紅背葉根對(duì)乙醇損傷L02 細(xì)胞三酰甘油水平和Cav-1mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響(x±s)

2.4 不同濃度紅背葉根對(duì)乙醇損傷L02 細(xì)胞Cav-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響 與空白對(duì)照組比較，不同濃度紅背葉根組Cav-1 mRNA表達(dá)水平均升高(均P<0.05)，且0 mg/mL、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL、3.125 mg/mL紅背葉根組Cav-1 mRNA表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見表3。

3 討 論

肝病至今仍是人類沉重的健康負(fù)擔(dān)和五大死亡原因之一，肝病的發(fā)病率及其相關(guān)死亡率亦無減輕跡象[9]。作為重要的慢性非傳染性疾病，脂肪性肝病現(xiàn)已取代病毒性肝炎成為全球第一大肝病，對(duì)人類健康和社會(huì)發(fā)展造成嚴(yán)重危害[10]。我國(guó)是肝病大國(guó)，在未來幾年時(shí)間里，脂肪性肝病可能將成為我國(guó)肝病防治的主要對(duì)象，因此，防治脂肪性肝病的緊迫性和必要性日益凸顯[11]。脂肪性肝病按病因可分為酒精性脂肪肝[12]和非酒精性脂肪肝[13-14]。目前用于治療脂肪性肝病的藥物都存在療效不確切、副作用大等缺點(diǎn)。研發(fā)高效、價(jià)廉、方便、安全的脂肪性肝病治療藥物有重要意義。

在民間紅背葉根用于保肝的歷史悠久，療效確切。本課題組前期研究證實(shí)紅背葉根對(duì)四氯化碳復(fù)合因素及酒精性肝纖維化大鼠均有保肝、降酶、抗肝纖維化的作用[7-8]，并能顯著降低肝纖維化大鼠全血黏度指數(shù)，改善循環(huán)[15]，同時(shí)具有抗病毒作用[16]；另外，紅背葉根還可以通過抑制TNF-α、白細(xì)胞介素6、Toll樣受體4等，發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激作用，從而達(dá)到防治急性肝損傷的效果[16-22]。本研究結(jié)果顯示，一定濃度紅背葉根水提物可以提高乙醇損傷L02細(xì)胞的存活率，提示紅背葉根水提物對(duì)乙醇損傷的L02細(xì)胞有保護(hù)作用。

正常肝臟內(nèi)脂肪含量占5%,當(dāng)肝內(nèi)脂肪含量明顯增加,肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪顆粒時(shí),稱脂肪肝。各種原因所致的高脂血癥均可伴有肝脂肪浸潤(rùn),以三酰甘油增高最為常見[23]。研究表明,三酰甘油主要為肝臟提供能量并為新生細(xì)胞膜的形成提供不飽和脂肪酸,三酰甘油的聚集是肝再生過程中的重要因素，Cav-1可通過影響三酰甘油的蓄積來參與脂肪代謝進(jìn)而影響肝再生過程[24]。因此，本研究通過檢測(cè)三酰甘油及Cav-1 mRNA水平來探討紅背葉根水提物對(duì)酒精性脂肪肝模型細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，不同濃度紅背葉根組三酰甘油及Cav-1 mRNA表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組，但0 mg/mL、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL、3.125 mg/mL紅背葉根組三酰甘油、Cav-1 mRNA水平依次降低(P<0.05)。提示紅背葉根水提物可能通過降低三酰甘油及Cav-1 mRNA表達(dá)水平而發(fā)揮保護(hù)酒精性脂肪肝的作用，且具有一定的濃度依賴性，Cav-1 可能是紅背葉根防治酒精性脂肪肝的作用靶點(diǎn)之一。

綜上所述,紅背葉根水提物可能通過降低三酰甘油水平及Cav-1 mRNA表達(dá)，發(fā)揮對(duì)酒精性脂肪肝的防治作用。