駱維 孟憲勇

摘要：目的：建立高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定大黃七味酊中主要成分大黃素和大黃酚含量的方法。方法 采用HPLC的方法，色譜柱為Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6mm，5?m），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（80：20），流速1.0 ml.min-1，柱溫35℃，檢測波長254nm，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果 大黃素、大黃酚的線性范圍分別為2.04μg.mL-1～24.48μg.mL-1（r2 = 0.9995）、2.00μg.mL-1～24.00μg.mL-1（r2 = 0.9993），精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)均符合要求。大黃素、大黃酚回收率大于95%，RSD在0.23%～1.15%（N=9）。結(jié)論 HPLC測定大黃七味酊主要成分含量方法簡便靈敏，準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，可用于大黃七味酊的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：大黃七味酊;高效液相色譜法;質(zhì)量控制

【中圖分類號(hào)】R246.7 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ?【文章編號(hào)】1673-9026（2021）06-154-02

0引言

大黃七味酊是武漢特勤療養(yǎng)中心使用近四十年的醫(yī)院制劑，獲得非標(biāo)準(zhǔn)制劑批文（總制字（2016）F606011），現(xiàn)已被《中國人民解放醫(yī)療制劑規(guī)范》（2015版）第一部所收載。該制劑為復(fù)方制劑，包含羊蹄、虎杖、當(dāng)歸、雷公藤、辣椒、蛇床子、大黃7味中藥飲片粗粉的70%乙醇浸泡液。其具有清熱解毒，活血止痛，殺蟲止癢之功效[1]。臨床上主要用于治療銀屑病、濕疹及皮炎等皮膚疾病[2]。2012年醫(yī)院申請全軍非標(biāo)準(zhǔn)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高獲面上課題經(jīng)費(fèi)支持。本文參照《中國藥典》等，建立了HPLC色譜法，檢測該制劑中主要中藥成分大黃素和大黃酚的含量，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定大黃七味酊中含大黃素和大黃酚的總量不得少于0.18 mg.ml-1作為其質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1材料

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies Inc.），Chem Staus色譜工作站（美國Agilent Technologies Inc.）;AUW220電子天平（日本Shimadzu公司）;AS3120型超聲清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

大黃七味酊（141107、141118），由武漢特勤療養(yǎng)中心療養(yǎng)四區(qū)制劑室配制;大黃素對照品（純度98.7%，批號(hào)：0756-200110）大黃酚對照品（純度99.2%，批號(hào)：110796-201017），購自中國食品藥品檢定研究院;磷酸為分析純，甲醇為色譜純。

2方法和結(jié)果

2.1 ?色譜條件 ?色譜柱： Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6mm，5?m），美國Agilent公司;流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（80：20）;流速1.0 mL.min-1;柱溫35℃;檢測波長為254nm;進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 對照品溶液的配制 ? 精密稱定大黃素10.2mg置50mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成含204μg.mL-1的大黃素對照品儲(chǔ)備液。精密稱定大黃酚10.0mg置50mL量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成200μg.mL-1的大黃酚對照品儲(chǔ)備液。

2.3供試品溶液的制備 ?精密量取大黃七味酊5mL，置錐形瓶中，蒸干，精密加甲醇25mL，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置圓底燒瓶中，揮去溶劑，加2.5mol.L-1硫酸溶液10 mL，超聲處理（功率120W，頻率45kHz） 5min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流l小時(shí)，冷卻，移至分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次10mL，合并三氯甲烷液。三氯甲烷液用鋪有無水硫酸鈉2g的漏斗濾過，合并三氯甲烷液，回收溶劑至蒸干，殘?jiān)芗尤爰状?5mL，稱定重量，置水浴中微熱溶解殘?jiān)爬?，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得[3]。

2.4陰性樣品溶液的制備 ?按處方稱取藥材（除去大黃、羊蹄），按制備工藝制備缺大黃素和大黃酚的樣品，再按“2.3供試品溶液的制備”，配制陰性對照品溶液。

2.5 專屬性考察 ?在“2.1”色譜條件下，大黃素和大黃酚對照品、供試品中大黃素和大黃酚的保留時(shí)間分別約為9.69min，13.75min，陰性樣品溶液在上述保留時(shí)間沒有峰值，所以其他成分對測定無干擾，見圖1。

2.6 ?線性與范圍 ?分別精密量取大黃素、大黃酚對照品儲(chǔ)備液0.5、1、1、2、5、3mL，分別置于50、50、20、25、50、25mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為線性測試溶液。精密量取以上測試溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖和峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸處理，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見表1和圖2。

2.7 ?中間精密度試驗(yàn) ?測試溶液的制備：在不同的檢查日期，不同的試驗(yàn)人員，按“2.3供試品溶液的制備”法將供試品（批號(hào)：121107）溶液配制6份，作為測試溶液。按“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析大黃素和大黃酚含量，大黃素和大黃酚各6次測定結(jié)果的RSD分別為0.93%、0.79%，結(jié)果表明本品測定方法中間精密度良好。

2.8 ?精密度試驗(yàn) ?精密量取大黃素、大黃酚混合對照品溶液（每mL含大黃素16.32μg.mL1、大黃酚16.00μg.mL-1）20?L，注入液相色譜儀記錄色譜圖，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%值），大黃素、大黃酚對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次的主峰面積RSD%分別為0.11%、0.09%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表2。

2.7 ?重復(fù)性試驗(yàn) ?取同一批次（批號(hào)：121107） 樣品5mL，按“2.3供試品溶液制備”配制供試品溶液，平行配制6份供試品溶液。在“2.1”色譜條件項(xiàng)進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各份供試品的含量，測得大黃素、大黃酚含量RSD分別為1.07%、0.90%。表明本方法的重復(fù)性良好。

2.8 ?加樣回收率試驗(yàn) ?測試溶液的制備：取同一批號(hào)（批號(hào)：121107） 1mL，精密吸取大黃素、大黃酚對照品儲(chǔ)備液適量，置錐形瓶中，蒸干，按“2.3供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，制備低、中、高3個(gè)濃度的溶液，每個(gè)濃度平行配制3份作為準(zhǔn)確度測試溶液。按“2.1”色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，測定大黃素、大黃酚的含量，計(jì)算加樣回收率，大黃素、大黃酚低、中、高3個(gè)濃度的加樣回收率均高于95%，RSD%均低于2%，表明本含量測定方法的可行。結(jié)果見表3

2.9 ?穩(wěn)定性試驗(yàn) ?取本品（批號(hào)：121107）5mL按“2.3供試品溶液的制備”方法，配制供試品溶液，室溫放置。分別于0、2、4、6、8、12小時(shí)取樣，按“2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析測得大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為0.64%，0.88%（n=3）。表明供試品中大黃素和大黃酚在室溫12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 含量的測定 ?分別取2批次（批號(hào)：141107、141118）獨(dú)立包裝大黃七位酊5mL，按“2.3供試品溶液的制備”方法處理，制備供試品溶液。按“2.1”色譜條件測定大黃素、大黃酚含量，每批次平行測定3次，結(jié)果見表4

3討論

通過紫外可見分光光度計(jì)掃描功能，對規(guī)定含量的大黃對照品、大黃酚對照品和陰性溶液進(jìn)行光譜掃描，由光譜圖可看出，大黃素在波長200～220nm、240～310nm有較大吸收，大黃酚在波長210～230nm、240～270nm有較大吸收峰，陰性樣品溶液在波長250～300nm之間無輔料、溶劑的吸收。結(jié)合《中國藥典》綜合考慮，選擇254nm作為測定波長。在該波長下待測成分均出峰且峰型良好，響應(yīng)值較高，基線平穩(wěn)[4-5]。

本試驗(yàn)建立了一種可以測定醫(yī)院非標(biāo)準(zhǔn)制劑大黃七味酊中大黃素、大黃酚含量的方法，考慮中藥材原產(chǎn)地不同、浸泡時(shí)間不同等，故將大黃素和大黃酚的總含量不少于0.18μg.mL-1 作為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。該方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為大黃七味酊的質(zhì)量控制方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]孟飛，宋學(xué)立.白蘞藥材中大黃素含量的反相高效液相色譜法測定[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2020，38（03）：264-267.

[2]蔡天進(jìn)，劉金來，楊金招，朱雪瓊，金甌.消腫解毒膏中大黃素、大黃酚的含量測定[J].海峽藥學(xué)，2020，32（02）：60-62.

[3]張憲，李岳.高效液相色譜法同時(shí)測定麻仁丸中大黃素、大黃酚、大黃酸及厚樸酚含量[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2019（10）：1107-1110.

[4]吳勇，劉燕，陳衛(wèi)東，王雷.高效液相色譜法同時(shí)測定大黃碳酸氫鈉片中5種成分的含量[J].中南藥學(xué)，2019，17（10）：1718-1720.

[5]文花，劉燕，董武，白玉霞.HPLC法同時(shí)測定蒙藥給喜古訥-6中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2019，25（08）：41-43.

武漢特勤療養(yǎng)中心 ?湖北武漢 ?430000

課題編號(hào)：14ZJZ07-1

課題題目：皮膚病外用非標(biāo)準(zhǔn)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高的研究