李建偉 田文靜 劉民

(1滄州市中心醫(yī)院泌尿外二科，河北 滄州 061001；2滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)

膀胱癌屬于泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其主要生物學(xué)特性為侵襲性強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等，但胰腺癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明〔1〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)可通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)而參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明長鏈非編碼RNA Linc00152(LncRNA Linc00152)在惡性腫瘤中高表達(dá)，并可在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用〔2〕。Linc00152可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生物行為進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展〔3〕。研究報(bào)道指出Linc00152過表達(dá)可促進(jìn)肝癌、血管瘤細(xì)胞的增殖、遷移〔4～6〕。但Linc00152對膀胱癌生物行為及放射敏感性的影響尚未見報(bào)道。研究表明微小RNA-103a-3p(miR-103a-3p)在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著降低，同時(shí)TCF25可通過miR-103a-3p/miR-107調(diào)控CDK6的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)膀胱癌的增殖遷移〔7〕。通過對Linc00152下游靶基因進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-103a-3p可能為Linc00152作用靶點(diǎn)，但Linc00152是否通過調(diào)控miR-103a-3p表達(dá)進(jìn)而參與膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡過程及其對細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系尚未可知。因此，本研究通過觀察Linc00152表達(dá)變化對膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡及放射敏感性的影響，并探討其是否通過調(diào)控miR-103a-3p表達(dá)而發(fā)揮作用，為深入研究膀胱癌發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2016年3～12月滄州市中心醫(yī)院收治的膀胱癌患者41例為研究對象，所有患者進(jìn)行手術(shù)且經(jīng)病理證實(shí)為膀胱癌，男21例，女20例，年齡55～70〔平均(65.32±6.58)〕歲，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情且簽署同意書。于術(shù)中切除膀胱癌組織及癌旁組織標(biāo)本(>5 cm)，放入液氮中保存，術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與主要試劑 膀胱癌BIU-87細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑與Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；siRNA、miR-103a-3p mimcs、miR-103a-3p抑制劑(anti-miR-103a-3p)及其各自陰性對照均購自上海吉瑪生物科技有限公司；WT-Linc00152、MUT-Linc00152載體均購自上海吉瑪制藥有限公司；CyclinD1、Bcl-2、P21、Bax抗體均購自美國CST公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司；噻唑藍(lán)(MTT)檢測試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Annexin V-FITC雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染與處理 膀胱癌BIU-87細(xì)胞放入含有10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素混合溶液的RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期膀胱癌BIU-87細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞生長融合度達(dá)到50%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)將膀胱癌BIU-87細(xì)胞分為si-NC組(轉(zhuǎn)染Linc00152的陰性對照)、si-Linc00152組(轉(zhuǎn)染Linc00152-siRNA)、miR-NC(轉(zhuǎn)染miR-103a-3p陰性對照)組、miR-103a-3p(轉(zhuǎn)染miR-103a-3p mimics)組、si-Linc00152+anti-miR-NC組(共轉(zhuǎn)染Linc00152-siRNA與anti-miR-NC)、si-Linc00152+anti-miR-103a-3p組(共轉(zhuǎn)染Linc00152-siRNA與anti-miR-103a-3p)，轉(zhuǎn)染48 h后采用qRT-PCR檢測膀胱癌BIU-87細(xì)胞中Linc00152與miR-103a-3p的表達(dá)水平鑒定轉(zhuǎn)染效果。

1.3.2qRT-PCR檢測Linc00152、miR-103a-3p表達(dá) 分別取各組膀胱癌BIU-87細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用NanoDrop檢測RNA濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min循環(huán)1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。Linc00152以GAPDH為內(nèi)參，miR-103a-3p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Linc00152、miR-103a-3p相對表達(dá)量。

1.3.3MTT檢測細(xì)胞增殖 收集對數(shù)生長期膀胱癌BIU-87細(xì)胞，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，在接種后24 h、48 h、72 h分別加入MTT溶液(20 μl/孔)，培養(yǎng)4 h后，每孔分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻，利用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度(OD)值。

1.3.4檢測細(xì)胞凋亡率 預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌膀胱癌BIU-87細(xì)胞，加入100 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，取5×105個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，PBS洗滌，加入5 μl Annexin V-FITC，避光孵育15 min，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，離心半徑6 cm，加入5 μl PI，避光孵育15 min，加入400 μl 1×結(jié)合緩沖液，充分混勻，置于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.5Western印跡檢測CyclinD1、Bcl-2 P21、Bax蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期膀胱癌BIU-87細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，蛋白變性后，取30 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)膜、封閉，加入CyclinD1、Bcl-2 P21、Bax一抗(稀釋比1∶200)，4℃孵育24 h，加入二抗(稀釋比1∶1 000)，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，PBST洗滌，滴加ECL發(fā)光試劑，放入凝膠成像儀并應(yīng)用Quantity One軟件分析蛋白灰度值。

1.3.6克隆形成實(shí)驗(yàn) 收取生長良好的膀胱癌BIU-87細(xì)胞，用0、2、4、6、8 Gy不同照射劑量照射細(xì)胞，放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，PBS洗滌3次×10 min，使用甲醇固定20 min，吉姆薩染色40 min，洗滌后置于顯微鏡下觀察形成的集落數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)與放射增敏比。

1.3.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)Linc00152與miR-103a-3p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建含有結(jié)合位點(diǎn)序列的野生型WT-Linc00152報(bào)告基因載體，將Linc00152與miR-103a-3p結(jié)合位點(diǎn)突變序列構(gòu)建到報(bào)告基因載體記為MUT-Linc00152，同時(shí)將膀胱癌BIU-87細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞生長融合度達(dá)50%～80%時(shí)分別將miR-103a-3p mimic或miR-NC與WT-Linc00152、MUT-Linc00152共轉(zhuǎn)染BIU-87細(xì)胞，根據(jù)熒光素酶檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞并檢測各細(xì)胞相對熒光素酶活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1Linc00152在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 與癌旁組織(0.25±0.02)相比，膀胱癌組織(0.93±0.09)中Linc00152的表達(dá)水平顯著升高(t=47.227,P=0.000)。

2.2抑制Linc00152對細(xì)胞BIU-87增殖、凋亡的影響 相較于si-NC組，si-Linc00152組膀胱癌 BIU-87細(xì)胞中Linc00152的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染效果良好。與si-NC組相比，si-Linc00152組膀胱癌 BIU-87細(xì)胞增殖活性明顯降低(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，而P21、Bax蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)。見圖1，圖2，表1。表明抑制Linc00152表達(dá)可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)而抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖1 抑制Linc00152對細(xì)胞BIU-87凋亡的影響

圖2 抑制Linc00152對細(xì)胞BIU-87增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表1 抑制Linc00152對細(xì)胞BIU-87增殖和凋亡的影響

2.3抑制Linc00152表達(dá)聯(lián)合放射對細(xì)胞BIU-87存活率的影響 用不同照射劑量照射膀胱癌細(xì)胞后，si-Linc00152組膀胱癌細(xì)胞存活率與si-NC組比較顯著下降(P<0.05)，增敏比(SER)為1.879，見表2、表3。表明抑制Linc00152表達(dá)可明顯增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞放射敏感性。

表2 抑制Linc00152對細(xì)胞BIU-87存活分?jǐn)?shù)的影響

表3 單擊多靶模型參數(shù)

2.4Linc00152靶向、調(diào)控miR-103a-3p 靶基因預(yù)測結(jié)果顯示Linc00152的3′UTR中含有與miR-103a-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖3。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC組比較，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Linc00152與miR-103a-3p mimics后可顯著降低膀胱癌細(xì)胞的熒光素酶活性(P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染MUT-Linc00152與miR-103a-3p mimics后膀胱癌細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，見表4。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組(0.22±0.02)相比，pcDNA3.1-Linc00152組(0.09±0.01)膀胱癌細(xì)胞中miR-103a-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與si-NC組(0.23±0.02)相比，si-Linc00152組(0.67±0.06)膀胱癌細(xì)胞中miR-103a-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖3 Linc00152靶向miR-103a-3p

2.5過表達(dá)miR-103a-3p對細(xì)胞BIU-87增殖、凋

亡及放射敏感性的影響 與miR-NC組相比，miR-103a-3p組膀胱癌細(xì)胞中miR-103a-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。提示轉(zhuǎn)染效果良好。相對于miR-NC組，miR-103a-3p組膀胱癌細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均顯著降低(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而P21、Bax白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，見圖4、表5～表7。

表7 單擊多靶模型參數(shù)

圖4 過表達(dá)miR-103a-3p對細(xì)胞BIU-87增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表5 過表達(dá)miR-103a-3p對細(xì)胞BIU-87增殖及凋亡的影響

表6 miR-103a-3p對細(xì)胞BIU-87存活分?jǐn)?shù)的影響

2.6抑制細(xì)胞miR-103a-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制Linc00152對細(xì)胞BIU-87增殖、凋亡及放射敏感性的影響 si-Linc00152+anti-miR-103a-3p組膀胱癌細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)較si-Linc00152+anti-miR-NC組顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞活性與細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均明顯升高(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，增敏比(SER)明顯降低，CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，而P21、Bax蛋白表達(dá)量明顯降低

(P<0.05)，見圖5、表8～10。

1～2：si-Linc00152+anti-miR-NC組，si-Linc00152+anti-miR-103a-3p組圖5 抑制細(xì)胞miR-103a-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制Linc00152對細(xì)胞BIU-87增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表8 抑制 miR-103a-3p對抑制Linc00152處理的細(xì)胞BIU-87存活分?jǐn)?shù)的影響

表9 抑制細(xì)胞miR-103a-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制Linc00152對細(xì)胞BIU-87增殖及凋亡的影響

表10 單擊多靶模型參數(shù)

3 討 論

隨著膀胱癌致病機(jī)制研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)尋找高度可靠性的生物標(biāo)志物對膀胱癌診斷及治療均具有重要意義，部分LncRNA可作為多種惡性腫瘤診斷及治療的重要標(biāo)志物〔8〕。目前臨床采用放射、手術(shù)及化療等方式治療膀胱癌，但部分患者對放射治療具有一定抵抗性導(dǎo)致患者5年生存率較低〔9〕。因而深入探討膀胱癌發(fā)病機(jī)制對增強(qiáng)放射敏感性具有一定現(xiàn)實(shí)意義。LncRNA常通過誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷、沉默miRNA、或調(diào)控細(xì)胞遷移及侵襲等過程參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程〔10〕。因此，本研究尋找新型LncRNA分子并分析其與miRNA在膀胱癌發(fā)生及發(fā)展過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為提高治療效果及治療方案的制定提供指導(dǎo)依據(jù)。

Linc00152在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯升高，通過下調(diào)Linc00152表達(dá)可明顯降低胃癌細(xì)胞增殖速度并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)可降低細(xì)胞遷移及侵襲能力，進(jìn)一步研究〔11，12〕表明Linc00152可通過調(diào)控miR-17-5p表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及遷移。Yang等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)Linc00152在食管鱗癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖及遷移。Li等〔14〕研究表明Linc00152可通過調(diào)控miR-139-5p表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖及侵襲。研究〔15，16〕表明P21可抑制CyclinD1與CDK復(fù)合物活性而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G1期進(jìn)而抑制細(xì)胞生長，細(xì)胞凋亡對細(xì)胞存活及穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，Bcl-2與Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，Bcl-2屬于凋亡抑制因子，而Bax是凋亡促進(jìn)因子。說明抑制Linc00152表達(dá)可能通過下調(diào)CyclinD1、Bcl-2及上調(diào)P21、Bax表達(dá)進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。提示抑制Linc00152表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞放射敏感性。

miR-103a-3p在肝癌、肺癌中等低表達(dá)并可發(fā)揮抑癌基因作用，研究〔17，18〕表明miR-103a-3p過表達(dá)可能通過靶向調(diào)控FEZF1/CDC25A表達(dá)進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。miR-103a-3p在卵巢癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤組織及細(xì)胞系中均呈低表達(dá)，并可能作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子，研究〔19,20〕表明miR-103a-3p可通過靶向調(diào)控PDK4表達(dá)而減弱乳腺癌細(xì)胞糖酵解活動(dòng)進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。本研究通過靶基因預(yù)測顯示miR-103a-3p可能是Linc00152的靶基因，采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)Linc00152可作為miR-103a-3p競爭性吸附cRNA分子，并負(fù)向調(diào)控miR-103a-3p表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-103a-3p過表達(dá)可明顯抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并可增強(qiáng)細(xì)胞放射敏感性，提示miR-103a-3p過表達(dá)可通過調(diào)控膀胱癌細(xì)胞增殖及凋亡過程進(jìn)而參與膀胱癌發(fā)生及發(fā)展過程。

綜上所述，Linc00152在膀胱癌中呈高表達(dá)，抑制其表達(dá)后可通過調(diào)控miR-103a-3p表達(dá)進(jìn)而影響膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡及其放射敏感性，可為膀胱癌診斷及治療提供新方向。但關(guān)于Linc00152在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及其在臨床診斷中的應(yīng)用仍需深入研究。