吳欣 黃鴻菲 姜棟棟
(1濰坊護(hù)理職業(yè)學(xué)院解剖教研室,山東 濰坊 262500;2陽(yáng)光融和醫(yī)院消化內(nèi)科;3濰坊市中醫(yī)院病理科)
胃癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)中的惡性腫瘤之一,雖然放化療能夠延長(zhǎng)患者的生存期,但副作用較明顯,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,在分子水平抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療方式越來(lái)越受到人們關(guān)注,眾多靶向藥物為晚期胃癌的治療提供了良好的前景,分子靶向治療已成為一種新興治療手段,在胃癌治療中受到廣泛關(guān)注〔1~3〕。
長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是長(zhǎng)度大于200bp的非編碼RNAs,其異常表達(dá)在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程〔4〕。尿路上皮癌胚抗原(UCA)1最初是在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)的一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA〔5〕,UCA1在多種腫瘤中高表達(dá),作為癌基因起作用〔6〕,在胃癌的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、多藥耐藥等方面發(fā)揮重要的作用〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔8〕。miR-873能抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞的侵襲〔9〕。miR-873影響肝癌患者生存率,在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移〔10〕。miR-873-5p可阻滯膀胱癌細(xì)胞周期進(jìn)展,抑制細(xì)胞的增殖〔11〕。本研究將探尋LncRNA UCA1通對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響,分析UCA1和miR-873的靶向關(guān)系。
1.1材料與試劑 胃癌細(xì)胞SGC-7901和胃黏膜上皮正常細(xì)胞系GES-1均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;AceQ qPCR SYBR? Green Mix購(gòu)自南京vazyme生物公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。
1.2方法
1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 胃癌細(xì)胞SGC-7901和胃黏膜上皮正常細(xì)胞系GES-1常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌細(xì)胞SGC-7901,將其分為si-con組(si-con)、si-UCA1組、miR-con組、miR-873組、si-UCA1+anti-miR-con組、si-UCA1+anti-miR-873組。
LncRNA-UCA1干擾序列(siRNA)及陰性對(duì)照序列(si-con)分別為:siRNA正義鏈:5′-AAGAGCCGATCAGACAAACAA-3′,反義鏈:5′-UUGUUUGUCUGAUCGGCUCUU-3′;si-con 正義鏈:5′-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′,反義鏈:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAUU-3′;miR-873 mimics正義鏈:5′-GCAGGAACTTGTGAGTCTCCT-3′,反義鏈:5′-AGGAGACTCACAAGTTCCT -3′。
1.2.2qRT-PCR分析UCA1及miR-873表達(dá)水平 提取細(xì)胞總RNA,合成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR方法擴(kuò)增,相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。UCA1引物序列:上游引物:5′-TTTGCCAGCCTCAGCTTAAT-3′;下游引物:5′-TTGTCCCCATTTTCCATCAT-3′;內(nèi)參GAPDH:上游引物:5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3′;下游引物:5′-GCCTCAAGATCAGCAAT-3′;miR-873上游引物:5′-ACACTCCAGCTGGGGCAGGAACTTGTGAG-3′;下游引物:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。
1.2.3CCK-8法測(cè)定沉默UCA1、過(guò)表達(dá)miR-873和抑制表達(dá)miR-873逆轉(zhuǎn)si-UCA1對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 分別取si-con組、si-UCA1組、miR-con組、miR-873組、si-UCA1+anti-miR-con組和si-UCA1+anti-miR-873組的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,消化后接種于96孔板培養(yǎng),分別于24 h、48 h和72 h加入CCK-8試劑。孵育2 h后檢測(cè)490 nm處OD值。
1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 收集si-con組、si-UCA1組、miR-con組、miR-873組、si-UCA1+anti-miR-con組和si-UCA1+anti-miR-873組細(xì)胞,無(wú)血清培養(yǎng),取100 μl接種于 Transwell 小室上層,培養(yǎng)24 h后用結(jié)晶紫染色,顯鏡下拍照并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn):在Transwell小室上層加入基質(zhì)膠,其余同遷移操作。
1.2.5熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建野生型和突變型基因靶點(diǎn)UCA1的熒光素酶表達(dá)載體(WT-UCA1和MUT-UCA1),將其分別與miR-873和miR-con共轉(zhuǎn)染,按試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)熒光素酶活性。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),方差分析。
2.1胃癌細(xì)胞SGC-7901中miR-873和UCA1的表達(dá) SGC-7901細(xì)胞中miR-873的表達(dá)水平顯著低于GES-1細(xì)胞;而UCA1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于GES-1細(xì)胞(P<0.05),見(jiàn)表1。
表1 檢測(cè)胃癌細(xì)胞SGC-7901和胃黏膜上皮正常細(xì)胞系GES-1中miR-873和UCA1的表達(dá)
2.2沉默UCA1的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖 與si-con組細(xì)胞相比,si-UCA1組SGC-7901細(xì)胞中UCA1 mRNA的表達(dá)水平顯著下降,SGC-7901細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表2。
表2 沉默UCA1的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖
2.3沉默UCA1的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移和侵襲 si-UCA1組胃癌細(xì)胞SGC-7901的遷移和侵襲數(shù)量顯著低于si-con組(P<0.05),見(jiàn)圖1,表3。
圖1 Transwell檢測(cè)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移數(shù)和侵襲數(shù)(結(jié)晶紫染色,×200)
表3 沉默UCA1的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移和侵襲個(gè))
2.4UCA1靶向調(diào)控miR-873的表達(dá) TargetScan預(yù)測(cè)顯示UCA1與miR-873存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。轉(zhuǎn)染miR-873和WT-UCA1后的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);而miR-873和MUT-UCA1的細(xì)胞熒光素酶活性差異不顯著。見(jiàn)表4。抑制UCA1表達(dá)后miR-873的表達(dá)水平升高(si-con組0.38±0.05,si-UCA1組1.69±0.13,P<0.05);而過(guò)表達(dá)UCA1后miR-873的表達(dá)水平降低(pcDNA組0.41±0.05、pcDNA-UCA1組0.16±0.03,P<0.05)。
表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)
圖2 UCA1靶向調(diào)控miR-873的序列信息
2.5過(guò)表達(dá)miR-873抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲 與miR-con組比較,miR-873組胃癌細(xì)胞中miR-873的表達(dá)水平顯著升高,細(xì)胞活性顯著降低,胃癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表5。
表5 過(guò)表達(dá)miR-873抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲
2.6抑制miR-873表達(dá)逆轉(zhuǎn)了沉默UCA1對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲的影響 與si-con組比較,si-UCA1組miR-873的表達(dá)水平顯著升高,SGC-7901細(xì)胞活性顯著降低,SGC-7901細(xì)胞遷多和侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05);與si-UCA1+anti-miR-con組比較,si-UCA1+anti-miR-873組SGC-7901細(xì)胞活性顯著升高,SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表6。
表6 抑制miR-873表達(dá)逆轉(zhuǎn)了沉默UCA1對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲的影響
LncRNAs的發(fā)現(xiàn)對(duì)胃癌發(fā)病的分子機(jī)制研究及發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)志物提供了可能〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)UCA1在多種消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用〔13〕。LncRNA UCA1在胃癌耐藥細(xì)胞中顯著高表達(dá),干擾UCA1表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥性,可作為治療胃癌耐藥的重要分子靶標(biāo)〔14〕。UCA1在腫瘤組織中高表達(dá),下調(diào)UCA1表達(dá)可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖〔15〕。UCA1通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKN)1B和細(xì)胞分裂周期25磷酸酶(CDC25)B改變細(xì)胞周期分布從而影響細(xì)胞增殖;通過(guò)調(diào)控腫瘤蛋白(TP)53和磷酸化蛋白激酶(p-AKT)影響胃癌細(xì)胞增殖和遷移,通過(guò)結(jié)合 miR-143調(diào)控人腺激肽釋放酶(HK)2表達(dá)影響胃癌細(xì)胞糖代謝過(guò)程〔16〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制UCA1表達(dá)可抑制SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲;與上述研究結(jié)果一致。
研究報(bào)道,miR-873-5p在胃癌組織中低表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-873-5p通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控膠質(zhì)瘤相關(guān)瘤基因(Gli)1降低細(xì)胞活力,增加細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯,在胃癌中起腫瘤抑制劑的作用〔17〕。miR-873-5p高表達(dá)可抑制阿爾茨海默病中神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔18〕。生長(zhǎng)停滯特異性轉(zhuǎn)錄本(GAS)5可通過(guò)與miR-873的相互作用抑制HIV-1復(fù)制〔19〕。miR-873通過(guò)靶向腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)5和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶結(jié)合蛋白(TAB)1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖〔20〕。miR-873通過(guò)靶向GLI1抑制H9C2心肌細(xì)胞增殖〔21〕。miR-873可通過(guò)抑制分化的胚胎軟骨細(xì)胞表達(dá)基因(DEC)2的表達(dá)抑制食管癌的進(jìn)展〔22〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,胃癌細(xì)胞中miR-873低表達(dá);過(guò)表達(dá)miR-873可降低胃癌細(xì)胞活性,減少遷移和侵襲數(shù)。
UCA1是胃癌細(xì)胞中的促癌因子,UCA1能夠下調(diào)miR-27b表達(dá)從而增強(qiáng)胃癌多藥耐藥性〔23〕。UCA1通過(guò)靶向miR-122促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲〔24〕。UCA1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-96/叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXO)3影響胰腺癌的細(xì)胞增殖,侵襲和遷移〔25〕。UCA1可靶向調(diào)節(jié)mi-R143調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡〔26〕。UCA1通過(guò)miR-184影響青蒿琥酯對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用〔27〕。UCA1可與miR-507相結(jié)合參與黑素瘤的細(xì)胞增殖,侵襲和G0/G1細(xì)胞周期停滯〔28〕。而UCA1與miR-873之間的靶向機(jī)制還未明確,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,UCA1可靶向調(diào)控miR-873的表達(dá),抑制miR-873表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制UCA1對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的作用。