王德利，冷佳蔚，姜 俊，胡文紅

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南 250101；2.山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南 250101）

焦糖色素是食品生產(chǎn)中常用的一種黑色著色劑，顏色呈黑褐色，經(jīng)常用于加入醬油和可樂中的一種用于改變顏色的添加劑[1]，其實(shí)焦糖色素也經(jīng)常被用于以中草藥提取物為原料生產(chǎn)的保健食品劑型中。焦糖色素生產(chǎn)時(shí)會(huì)產(chǎn)生致癌小分子副產(chǎn)物4-甲基咪唑（4-MI）[2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織研究發(fā)現(xiàn)，4-MI在動(dòng)物生長過程中能誘發(fā)動(dòng)物腫瘤的生長，同時(shí)此類小分子化合物也有可能致癌。1-甲基咪唑與2-MI和4-MI互為同分異構(gòu)體。

保健食品成分復(fù)雜含有多種添加劑、植物源性提取成分等，易造成定量不準(zhǔn)確，常用的樣品前處理方法有QuEchers法[3]和固相萃取法[4]等。液相色譜方法定量檢測時(shí)，基質(zhì)復(fù)雜定性不準(zhǔn)確，同時(shí)靈敏度不能達(dá)到痕量分析的要求，氣相色譜方法在保健食品前處理過程中目標(biāo)化合物需要進(jìn)行衍生化，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜耗時(shí)較長，光譜方法和電化學(xué)方法抗干擾能力差，定性和定量不準(zhǔn)確，因此不適合選擇這些方法。目前，對(duì)于保健食品中的1-MI、2-MI和4-MI則沒有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測的方法和數(shù)據(jù)。

建立一種液相色譜質(zhì)譜法測定保健食品中的甲基咪唑類化合物，通過固相萃取凈化方式對(duì)保健食品進(jìn)行處理，3種甲基咪唑類化合物同時(shí)進(jìn)行定量，并結(jié)合親水色譜保留模式，對(duì)保健食品中3種甲基咪唑類化合物進(jìn)行分離，串聯(lián)質(zhì)譜法能夠進(jìn)行定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1-甲基咪唑和4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：北京曼哈格生物科技有限公司；2-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；1-甲基咪唑-氘代內(nèi)標(biāo)，2-甲基咪唑-氘代內(nèi)標(biāo)，4-甲基咪唑-氘代內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：加拿大C/D/N ISOTopes 公司；甲醇，乙腈，甲酸銨：色譜純，德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H-Class超高效液相色譜儀：美國waters公司；SCIEX 5500質(zhì)譜儀：美國AB SCIEX公司；旋渦混合器：德國艾卡公司；離心機(jī)：德國西格瑪公司；氮吹儀：美國Organomation公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

儲(chǔ)備液配制：稱取3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10mg，用乙腈溶解定容至10mL，配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液配制：稱取3種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10mg，用乙腈溶解并定容至10mL，配制成1mg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：移取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液和1μg/mL同位素內(nèi)標(biāo)溶液，配制成10、50、100、200、500ng/mL系列的含50ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 處理方法

稱取2.0g樣品，加100μL 1μg/mL內(nèi)標(biāo)液，加入1%三氯乙酸20mL混合均勻，進(jìn)行超聲提取30min，在離心機(jī)8 000r/min高速離心5min后，把離心后的上清液取出放入另一離心管中。準(zhǔn)確移取10mL過陽離子固相萃取柱，分別用5mL 2%甲酸淋洗和5mL甲醇各淋洗一次，用10mL 5%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，45 ℃氮吹，加1.0mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，過膜，上機(jī)測定。

1.4.1 色譜條件

色譜柱：BEH HILIC；柱溫：40 ℃；流速：0.3mL/min；體積：2μL；流動(dòng)相：A為10mmol/L甲酸銨，B為乙腈。梯度程序如表1所示。

表1 流動(dòng)相梯度程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜離子源：ESI+；檢測方式：MRM監(jiān)測；氣簾氣：20.0L/h；碰撞氣：8L/h；離子噴霧電壓：5kV；離子源溫度：500 ℃；噴霧氣流速：50L/h；輔助氣流速：50L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取柱的選擇

保健食品樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，為了提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度，選擇使用固相萃取柱進(jìn)行樣品除去雜質(zhì)和富集目標(biāo)物。選擇不同保留機(jī)理的4種固相萃取柱C18、MCX、HLB和MAX對(duì)3種甲基咪唑類化合物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，如圖1所示。結(jié)果表明在HLB和MAX固相萃取柱上回收率在20%以下，幾乎沒有保留，由于3種甲基咪唑類化合物在酸性溶液中成為陽離子狀態(tài)，在HLB和MAX陰離子固相萃取柱上無法保留，導(dǎo)致回收率較低。3種化合物在C18固相萃取柱上回收率不超過60%，說明目標(biāo)物在C18固相萃取柱上保留能力也比較差，損失嚴(yán)重，最終導(dǎo)致定量結(jié)果偏差較大。當(dāng)使用MCX固相萃取柱時(shí)回收率能達(dá)到90%以上，說明3種甲基咪唑類化合物在酸性溶液中以陽離子存在，因此在MCX陽離子固相萃取柱中目標(biāo)物能夠以離子作用力保留，因此在進(jìn)一步的樣品前處理過程中選擇使用MCX固相萃取柱。

圖1 3種甲基咪唑在固相萃取柱中的回收率

2.2 固相萃取柱洗脫條件的優(yōu)化

考察洗脫溶液甲醇中氨水體積分?jǐn)?shù)對(duì)3種甲基咪唑化合物的洗脫能力，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，氨水比例5%時(shí)回收率最高，但當(dāng)氨水比例繼續(xù)增大時(shí)，回收率反而有所降低。分析可能是因?yàn)楫?dāng)洗脫溶液為堿性時(shí)，甲基咪唑類化合物以分子形式存在，能夠從MCX陽離子固相萃取柱上洗脫下來。通過以上分析可以得出選擇體積分?jǐn)?shù)5%氨水作為洗脫溶液最合適。

圖2 洗脫液中氨水比例優(yōu)化

2.3 色譜分離條件的優(yōu)化

通過化合物結(jié)構(gòu)分析，3種甲基咪唑類化合物極性較強(qiáng)，適合使用親水性的BEH HILIC色譜柱進(jìn)行分離，在實(shí)際分離3種目標(biāo)化合物時(shí)分離度和色譜峰性都很好，另3種目標(biāo)物在一種親水的BEH Amide色譜柱上色譜峰有明顯拖尾和色譜峰展寬現(xiàn)象，導(dǎo)致在定量時(shí)造成結(jié)果偏差較大。親水模式色譜與質(zhì)譜串聯(lián)兼容性更好，對(duì)3種甲基咪唑類化合物同時(shí)分離效果會(huì)更好，靈敏度也將得到極大提高，因此選擇BEH HILIC親水色譜柱進(jìn)行分離檢測。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

3種甲基咪唑產(chǎn)生m/z 56.1和m/z 42.1的碎片離子。碎片離子分別選擇作為定性與定量離子對(duì)，并通過優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，使碎片離子響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到最大。經(jīng)優(yōu)化后，3種甲基咪唑化合物及同位素內(nèi)標(biāo)物關(guān)鍵質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2 3種甲基咪唑及同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)

2.5 方法的線性范圍和檢出限

以化合物定量離子與內(nèi)標(biāo)定量離子峰面積比值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果，如表3所示。

表3 3種甲基咪唑線性方程、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.6 方法的回收率和精密度

采用兩種不含3種甲基咪唑類化合物的不同類型保健食品，進(jìn)行添加回收率和精密度的試驗(yàn)。保健食品樣品中添加10、50和100μg/kg三濃度水平，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，3種甲基咪唑化合物在不同基質(zhì)的回收率在95%～106.2%，RSD在2.1%～5.5%。

2.7 實(shí)際樣品測定

用本文建立的方法對(duì)市場上購買的50批次保健食品樣品進(jìn)行檢測。其中保健食品中1-MI未檢出，20批次2-MI含量最高為303.7μg/kg，25批次4-MI含量最高為3 510.4μg/kg。通過對(duì)比配料表總結(jié)出，配料中含有焦糖色素的保健食品有26批次，其中4-MI檢出有25批次，2-MI檢出有20批次。通過檢測結(jié)果可以看出含有焦糖色素的檢出率很高，可能是因?yàn)樵诮固巧厣a(chǎn)過程中產(chǎn)生了焦糖化，生成了有害的副產(chǎn)物甲基咪唑類化合物，可能不同工藝生產(chǎn)的焦糖色素產(chǎn)生的副產(chǎn)物含量也不同，因此保健食品中甲基咪唑類化合物的危害性有待評(píng)估。

3 結(jié)束語

通過對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇提取溶液為濃度1%的三氯乙酸，凈化固相萃取柱為MCX，該提取凈化方法能夠提高方法的靈敏度和準(zhǔn)確性，選擇BEH HILIC親水模式色譜柱，建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定保健食品中1-MI、2-MI和4-MI內(nèi)標(biāo)定量分析方法。