劉 鴻，陳 靜，李雅善，王艷君，張瑛莉，南立軍,4*，劉麗媛

（1.楚雄師范學(xué)院資源環(huán)境與化學(xué)學(xué)院，云南楚雄 675000；2.北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院，廣西欽州 535000；3.新疆罄玉酒莊有限公司，新疆巴音郭楞蒙古自治州 841400；4.云南省高校葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，云南楚雄 675000；5.吐魯番林果業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，新疆吐魯番 838000）

赭曲霉毒素有7 種結(jié)構(gòu)相似的化合物，其中，赭曲霉毒素A 是產(chǎn)毒量最多、分布最廣、污染農(nóng)產(chǎn)品最重的毒素[1-2]。赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）屬于弱有機(jī)酸[1]，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱性好[3]。由于其腎毒性、肝毒性、抑制RNA和蛋白質(zhì)合成等性質(zhì)，對人和動(dòng)物的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[4]。赭曲霉毒素A 污染極易發(fā)生在植株種植和葡萄酒釀制期間[5]。當(dāng)植株抗病力較弱或生長環(huán)境惡劣時(shí)更易受污染。在葡萄酒釀造過程中，相關(guān)的釀酒工具、陳釀容器等滅菌不到位，也易受到赭曲霉毒素A 污染。GB 2761 規(guī)定葡萄酒中的赭曲霉毒素A 含量上限為2 μg/kg[6]。

近年來赭曲霉毒素A 檢測方法主要有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、超高效液相-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜、化學(xué)發(fā)光生物傳感器、離子交換固相萃取柱結(jié)合高仙液相色譜儀等。王興龍等[7]認(rèn)為高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)有高靈敏度、較好的選擇性和分析效率，對高沸點(diǎn)、不易揮發(fā)和熱不穩(wěn)定化合物的分離鑒定有著獨(dú)特優(yōu)勢，已成為赭曲霉毒素A 最常用的檢測方法[8]。趙天宇等[9]和孫愛潔[10]采用高效液相色譜儀對葡萄酒中赭曲霉毒素A 進(jìn)行檢測，有明顯的效果。由于人們對食品安全健康越來越重視，因此加強(qiáng)對葡萄酒安全風(fēng)險(xiǎn)檢測關(guān)鍵技術(shù)的研究，可以提高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估能力，為葡萄酒安全檢驗(yàn)和監(jiān)督提供技術(shù)保障。

另一方面，由于葡萄品種的特性、栽培方式及環(huán)境等的影響，成熟度較差或不適宜釀酒的葡萄釀造的葡萄酒總酸會(huì)偏高，品嘗時(shí)給人酸澀粗糙的感覺，應(yīng)采取相應(yīng)的工藝措施完善[11]。我們通常采用化學(xué)降酸劑有碳酸鈣和酒石酸氫鉀。不同的降酸劑降酸效果不同。碳酸鈣降酸通常采用復(fù)鹽法，反應(yīng)速度快，成本較低，操作方便等[12]。酒石酸鹽降酸是利用其與酒石酸互相作用生成溶解度較低的酒石酸氫鹽，過濾除去，從而降低總酸含量[13]。降酸后葡萄酒的澄清度較好，酸澀感降低。但在葡萄酒降酸過程中，降酸的幅度過大，容易繁殖大量微生物，影響葡萄酒的質(zhì)量和感官質(zhì)量[14]。

本課題以夏黑葡萄為材料釀造干紅葡萄酒，通過降酸劑碳酸鈣和酒石酸氫鉀降酸，然后比較降酸前后葡萄酒中赭曲霉毒素A 含量的變化情況，有助于評(píng)估真菌毒素污染帶來的風(fēng)險(xiǎn)，提高葡萄酒的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料和酒樣

原料：夏黑葡萄，產(chǎn)于楚雄市。酒樣：樣品一，未降酸原酒；樣品二，經(jīng)0.12 g/100mL 碳酸鈣降酸處理。

1.1.2 試劑

碳酸鈣、酒石酸氫鉀、氫氧化鈉，天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲醇，天津市百世化工有限公司；三氯甲烷，成都市科隆化學(xué)品有限公司；石油醚、磷酸、酚酞、95%乙醇，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；去離子水，睿?；S處。

氧氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液；酚酞指示液；5%磷酸（體積分?jǐn)?shù)）；磷酸水溶液（pH=2.5）；赭曲霉毒素A 標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 μg/mL）。

1.1.3 輔料

亞硫酸、果膠酶，天津市大茂化學(xué)試劑廠；安琪釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

移液槍，德國埃彭多夫公司；恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；酸度計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；分液漏斗，濰坊銘陽實(shí)驗(yàn)分析儀器公司；附溫比重瓶，上海信誼儀器廠有限公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；醫(yī)用冷藏箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；高效液相色譜儀，島津（香港）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 干紅葡萄酒發(fā)酵及其工藝流程

葡萄→分選→除梗破碎→添加二氧化硫、果膠酶及酵母→浸漬發(fā)酵→發(fā)酵監(jiān)控（比重、溫度）→發(fā)酵結(jié)束測定基本理化指標(biāo)→酒的后期管理

1.2.2 干紅葡萄酒降酸處理

（1）確定葡萄酒降酸劑梯度

通過對干紅葡萄酒進(jìn)行感官品嘗，以及測定出的葡萄酒的總酸量，從而確定干紅葡萄酒的降酸梯度。經(jīng)計(jì)算碳酸鈣用量為0.120 0 g，則設(shè)置碳酸鈣的降酸梯度為0、0.100 0、0.110 0、0.120 0、0.130 0 g。經(jīng)計(jì)算酒石酸氫鉀用量為0.225 6 g，則設(shè)置酒石酸氫鉀的梯度為0、0.205 6、0.215 6、0.225 6、0.235 6 g。

（2）降酸處理步驟

分別取30 mL 酒樣于5 個(gè)三角瓶中，分別加入不同量的碳酸鈣，溶解并混合均勻，靜置24 h 后，再加入70 mL 酒樣，待充分溶解后，冷凍，24 h 后除去沉淀，最后分別測定混合后干紅葡酒中總酸含量、pH 值。以不添加碳酸鈣的干紅葡萄酒為空白對照組。

取100 mL 酒樣，稱取酒石酸氫鉀加于5 組酒樣中，溶解并混合均勻，靜置24 h，去除沉淀，最后分別測定混合后干紅葡酒中總酸含量、pH 值。以不添加酒石酸氫鉀的干紅葡萄酒為空白對照組。

1.2.3 葡萄酒理化指標(biāo)檢測

總酸[15]、酒精度[16]和pH 值[17]參照相應(yīng)的方法。

1.2.4 感官品嘗

由組成10 人的評(píng)估小組，依據(jù)表1 中的指標(biāo)對上述經(jīng)降酸處理后的酒樣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，滿分為100 分，選擇出最適宜的降酸劑及降酸劑添加量。

表1 感官品評(píng)表Table 1 Sensory evaluation sheet

1.3 高效液相色譜法測定赭曲霉毒素A

1.3.1 赭曲霉毒素A 標(biāo)準(zhǔn)品測定

將配制好的赭曲霉毒素A 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，分別配制成濃度為1、5、10、20 μg/L 和50 μg/L 的赭曲霉毒素A 標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用HPLC 進(jìn)行分析，橫坐標(biāo)為相應(yīng)的赭曲霉毒素A 濃度，縱坐標(biāo)為色譜峰面積，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.2 樣品前處理

向分液漏斗中加入50 mL 干紅葡萄酒樣品，然后再加入50 mL 石油醚，按照規(guī)范操作對其進(jìn)行震蕩（10 min）以排氣；靜置待液體分層后對其進(jìn)行分離，將上層石油醚從上口倒出并將其棄去；再取25 mL 石油醚對下層液體進(jìn)行重復(fù)提取，靜置分層后，收集下層液體；量取25 mL 去離子水以及25 mL 三氯甲烷加入到上步操作中收集的液體中進(jìn)行重復(fù)萃取，對其進(jìn)行震蕩（10 min），靜置分層并分離后，收集下層溶液；上層用25 mL 三氯甲烷提取震蕩（10 min），三氯甲烷提取液進(jìn)行合并，用電熱套（40 ℃下）進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，待溶液快干時(shí)向其中加入2 mL甲醇，將其進(jìn)行溶解超聲后使用0.45 μm 濾膜進(jìn)行過濾并吹干，再用500 μL 流動(dòng)相（pH 為2.5 的磷酸水溶液與甲醇的比例為1∶1）溶解，進(jìn)樣10 μL[18]。

1.3.3 檢測條件

色譜柱：C18 柱，柱長250 mm，內(nèi)徑20 mm，粒徑5 μm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相A：水+5%磷酸（體積分?jǐn)?shù)），調(diào)至pH=2.5，用0.45 μm 濾膜過濾，脫氣；B：甲醇，A∶B=1∶1；進(jìn)樣量：10 μL；二元高壓梯度洗脫程序；紫外檢測器，檢測波長：333 nm。

1.3.4 樣品測定

將所用到的流動(dòng)相過濾并超聲脫氣20～30 min 后裝入液相濾頭，打開液相色譜儀及電腦電源，開啟輸液泵（Infusion pump）以及檢測器（Detector），進(jìn)行排氣泡操作。打開液相操作軟件，創(chuàng)建儀器分析條件，開啟輸液泵，以所用流動(dòng)相沖洗色譜柱，待基線平穩(wěn)后進(jìn)行進(jìn)樣。使用配套的液體進(jìn)樣針吸取處理好的樣品10 μL，在Load 狀態(tài)下打進(jìn)進(jìn)樣閥后迅速旋至Inject 狀態(tài)，系統(tǒng)開始測樣記錄。樣品一為未降酸酒樣，樣品二為降酸后酒樣。

對測定的樣品的色譜峰圖進(jìn)行分析，整理數(shù)據(jù)并得出結(jié)論。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄酒理化指標(biāo)檢測數(shù)據(jù)

由表2 可知，隨著碳酸鈣和酒石酸氫鉀添加量的增加，酒樣的總酸逐漸降低，酒精度則不變。其中碳酸鈣的添加量為0.100 0 g 時(shí)其總酸由原酒的8.7 g/L 降至6.1 g/L，pH 值則由2.8 升高至3.2；當(dāng)碳酸鈣的添加量為0.130 0 g 時(shí) 其總酸由原酒的8.7 g/L 降至5.0 g/L，pH 值則由2.8 升高至3.5，此組添加量對干紅葡萄酒的降酸效果最為明顯；酒石酸氫鉀的添加量為0.205 6 g 時(shí)其總酸由原酒的8.7 g/L 降至6.3 g/L，pH 值則由2.8 升高至3.0，酒石酸氫鉀的添加量為0.235 6 g 時(shí)，其總酸由原酒的8.7 g/L 降至5.1 g/L，pH 值則由2.8 升高至3.4，此組添加量對干紅葡萄酒的降酸效果最為明顯。

表2 未降酸葡萄酒的理化指標(biāo)Table 2 Physical and chemical indexes of unreduced acid wine

2.2 降酸效果比較及感官分析結(jié)果

由表3 可知，化學(xué)降酸劑碳酸鈣和酒石酸氫鉀對干紅葡萄酒都起到了降酸的作用，均可使葡萄酒總酸降低，pH 值升高。在使用碳酸鈣進(jìn)行降酸處理后，酒樣底部產(chǎn)生白色沉淀，通過自然靜置以及過濾的方法將酒樣底部的白色沉淀除去；而使用酒石酸氫鉀進(jìn)行降酸后的酒樣底部沒有明顯的沉淀。由縱向分析可得，隨著碳酸鈣和酒石酸氫鉀添加量的增加，葡萄酒的顏色及香氣基本不受影響，酒體酸感及余味受影響則較大，其中以碳酸鈣添加量為0.13 g 的梯度對酒體感官影響最大，降酸過量使得酒體變得乏力，寡淡，余味短，以添加量0.12 g 為最佳，平均分為81.8 分是8 組中最高，該添加量有效的降低了葡萄酒的酸感，酒樣澄清透明，呈深寶石紅色，具有黑色水果的香氣，且香氣濃郁，酒體較柔順，風(fēng)格典型明確。酒石酸氫鉀的降酸效果整體比碳酸鈣的差，且降酸后酒體整體都不如經(jīng)碳酸鈣降酸后的酒體協(xié)調(diào)?？傮w來看，碳酸鈣（復(fù)鹽法）降酸效果比酒石酸氫鉀的效果好。

表3 感官評(píng)分結(jié)果Table 3 Sensory evaluation results

通過兩種降酸劑處理后，對表3 進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，降酸劑對葡萄酒的顏色以及香氣影響不顯著，平均分都在18 分左右，與空白組（原酒樣）的打分相差不大，對葡萄酒的余味以及風(fēng)格兩個(gè)因素影響較為顯著。

2.3 赭曲霉毒素A 測定結(jié)果

梁桂娟等[19]研究發(fā)現(xiàn)，赭曲霉毒素A 標(biāo)準(zhǔn)品的峰值時(shí)間在11.8 min 前后，表明樣品中的赭曲霉毒素A 應(yīng)在高效液相色譜中進(jìn)樣11.8 min 前后出現(xiàn)高峰。

根據(jù)表4 中赭曲霉毒素A 標(biāo)準(zhǔn)曲線表繪制出赭曲霉毒素A 的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，線性回歸方程為Y=5074.4x+8801，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，在1～50 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，以三倍信噪比確定儀器檢出限為0.069 μg/L，以十倍信噪比確定儀器定量限為0.235 μg/L。

表4 樣品中赭曲霉毒素A 各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果Table 4 Ochratoxin A index results in samples

通過分析降酸前后兩個(gè)樣品的色譜峰圖后發(fā)現(xiàn)，梯度洗脫方法能夠有效地將干擾峰與赭曲霉毒素A 的峰分開，排除雜質(zhì)峰干擾[20]。兩個(gè)樣品中的赭曲霉毒素A 的保留時(shí)間均在11.5 min 前后，其中未經(jīng)降酸處理的樣品一中赭曲霉毒素A 的色譜峰圖保留時(shí)間如圖1 為11.449 min，經(jīng)碳酸鈣降酸（碳酸鈣添加量為0.12 g）處理的樣品二中赭曲霉毒素A 的色譜峰圖保留時(shí)間如圖2為11.551 min。酒樣中赭曲霉毒素A 在降酸前的峰面積和高度分別為79 841 和28 718，在降酸后的峰面積和高度分別為79 879 和28 753，計(jì)算降酸前、后樣品中的含量分別為0.033 9%和0.024 6%，表明降酸劑處理對葡萄酒中的赭曲霉毒素A 含量有一定的影響。

圖1 樣品一中赭曲霉毒素A 色譜峰圖Fig.1 Chromatographic peak of ochratoxin A in sample 1

圖2 樣品二中赭曲霉毒素A 色譜峰圖Fig.2 Chromatographic peak of ochratoxin A in sample 2

3 結(jié)論

本文研究了不同降酸劑對干紅葡萄酒的降酸效果以及最適梯度，并對降酸劑處理前后葡萄酒中赭曲霉毒素A 的含量變化情況進(jìn)行了研究，從改良葡萄酒感官質(zhì)量的角度出發(fā)對葡萄酒中存在的赭曲霉毒素A 進(jìn)行了分析。在經(jīng)品嘗小組品評(píng)打分后，以碳酸鈣添加量為0.12 g為最佳，平均分為81.8 分，是8 組中最高，有效地降低了葡萄酒的酸感，酒樣澄清透明，呈深寶石紅色，具有黑色水果的香氣，且香氣濃郁，酒體較柔順，風(fēng)格典型明確。

建立了一種簡單、高效的高效液相色譜檢測方法，測定了降酸前后干紅葡萄酒中的赭曲霉毒素A 的含量變化情況，樣品中的赭曲霉毒素A 的保留時(shí)間均在11.5 min 前后，其中未經(jīng)降酸處理的樣品1 中赭曲霉毒素A的色譜峰的保留時(shí)間為11.449 min，經(jīng)碳酸鈣降酸（碳酸鈣添加量為0.12 g）處理的樣品2 中赭曲霉毒素A 的色譜峰的保留時(shí)間為11.551 min。酒樣中赭曲霉毒素A 在降酸前的峰面積和高度分別為79 841 和28 718，降酸后的峰面積和高度分別為79 879 和28 753，計(jì)算降酸前、后樣品中的含量分別為0.0339%和0.0246%，表明降酸劑處理對葡萄酒中的赭曲霉毒素A 的含量有一定的影響作用。

在本試驗(yàn)中，樣品前處理方法采用液液萃取，操作較簡便，但是在操作過程中會(huì)存在乳化現(xiàn)象，且有機(jī)試劑在操作過程中對人有一定的傷害[21]。本實(shí)驗(yàn)考慮到成本以及實(shí)驗(yàn)室條件等因素，最終確定樣品前處理方式為液液萃取。由于實(shí)驗(yàn)室條件有限，部分有機(jī)試劑用類似功能的試劑代替；實(shí)驗(yàn)中所用的氯仿可用毒性較小且提取率高的的二氯甲烷代替。兩個(gè)酒樣中的赭曲霉毒素A 的色譜峰的保留時(shí)間與赭曲霉毒素A 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰的保留時(shí)間有一定的差別，其原因有以下幾點(diǎn)：一，由于樣品前處理過程中存在操作方法的誤差；二，由于流動(dòng)相中的色譜純乙腈使用色譜純甲醇代替，從而導(dǎo)致洗脫效果沒有理想中的好；三，由于儀器操作過程中存在操作方法的誤差。