楊琛 李興勇 張超 楊浩 黃琛 左鵬剛

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730030

2. 甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030

廢用性骨質(zhì)疏松癥(disuse osteoporosis, DOP)是由于骨骼機(jī)械負(fù)荷力的減少而引起局部或全身骨量丟失的疾病。DOP可發(fā)生于脊髓損傷不能運(yùn)動(dòng)的患者以及其他由于疾病或手術(shù)而長(zhǎng)期臥床休息的患者，此外，宇航員長(zhǎng)期處于太空失重環(huán)境下，其骨組織(尤其是下肢)由于缺乏正常的機(jī)械負(fù)荷刺激也會(huì)發(fā)生廢用性骨質(zhì)疏松[1]。DOP發(fā)生骨折的危險(xiǎn)程度是正常人的4倍，為家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。了解DOP的病因及發(fā)病機(jī)理，對(duì)于預(yù)防和治療DOP具有重要的臨床意義。當(dāng)前對(duì)DOP的病因病機(jī)學(xué)研究取得了一定進(jìn)展，但其具體的發(fā)病機(jī)制目前仍尚未完全明確[3]。

動(dòng)物模型在臨床前研究中發(fā)揮著不可替代的作用，理想的動(dòng)物模型對(duì)研究DOP的病因病機(jī)、發(fā)展過(guò)程、積極預(yù)防和藥物治療等具有重要意義。常用于構(gòu)建廢用性骨質(zhì)疏松模型的動(dòng)物有大鼠、小鼠、冬眠熊、火雞、豬、猴子靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型等。目前研究中常用的DOP動(dòng)物模型有去勢(shì)法動(dòng)物模型、固定法動(dòng)物模型和其他類型動(dòng)物模型(圖1)，現(xiàn)將以上造模方法進(jìn)行總結(jié)，為該病的造模研究提供有價(jià)值的參考依據(jù)。

圖1 常見(jiàn)的廢用性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的造模方法

1 去勢(shì)法動(dòng)物模型

1.1 脊髓切斷模型

此種造模方法具體為，剪開(kāi)大鼠的皮膚，剝離肌肉組織，在T10水平行椎板切除術(shù)，將脊髓完全橫切，脊髓橫斷10 d后，開(kāi)始出現(xiàn)DOP癥狀[4]。Jiang等[5]應(yīng)用此法的結(jié)果顯示，去脊髓大鼠ALPase活性、前膠原和骨鈣素的產(chǎn)生以及骨鈣素、Runx2和成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體的基因表達(dá)以及成骨細(xì)胞活性明顯低于后肢固定大鼠，即去脊髓大鼠成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械負(fù)荷的反應(yīng)低于對(duì)照組。Otzel等[6]使用T9椎板切除術(shù)聯(lián)合中重度脊髓挫傷造模法的結(jié)果表明，此模型顯示松質(zhì)骨迅速退化，皮質(zhì)骨逐漸喪失，并出現(xiàn)全骨機(jī)械缺陷，類似于在運(yùn)動(dòng)完全性脊髓損傷人群中觀察到的后遺癥，提出低睪酮和(或)瘦素可能是脊髓損傷后骨退化的分子機(jī)制的設(shè)想。

1.2 坐骨神經(jīng)切除模型

其造模方法為，通過(guò)手術(shù)法切除模型動(dòng)物的單側(cè)坐骨神經(jīng)，造成一側(cè)肢體的運(yùn)動(dòng)障礙而發(fā)生DOP。Brouwers等[7]將此模型與去卵巢大鼠模型的骨量丟失作比較，發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)大鼠模型的骨小梁數(shù)量、分離情況及骨骺端的連接性明顯比去卵巢大鼠模型差，即廢用模型比去卵巢模型的骨結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能更差。Desouza等[8]通過(guò)延長(zhǎng)這種模型動(dòng)物的脛骨長(zhǎng)度來(lái)驗(yàn)證恢復(fù)老齡小鼠的負(fù)荷反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)，長(zhǎng)期延長(zhǎng)脛骨會(huì)使機(jī)械適應(yīng)能力下降，增強(qiáng)骨皮質(zhì)強(qiáng)度而非骨小梁強(qiáng)度。此模型多用于藥物研發(fā)[9-10]。

1.3 臂叢神經(jīng)切除模型

該模型的造模方法為，將兔模型麻醉后切開(kāi)暴露術(shù)野，分離全臂叢神經(jīng)到神經(jīng)根孔處切斷并向遠(yuǎn)端游離2 cm切斷后曠置，縫合，造成該側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙而逐漸出現(xiàn)DOP[11]。該模型造模原理與坐骨神經(jīng)切除模型原理相似，但既往文獻(xiàn)中關(guān)于此種模型的報(bào)道較少。

2 固定法動(dòng)物模型

2.1 尾部懸吊模型

尾部懸吊模型是目前使用最廣泛的DOP造模方法，具體[12]為，使用70 %的乙醇清洗動(dòng)物尾巴后涂上安息香酊劑，將外科手術(shù)膠帶綁在尾巴的末端形成一個(gè)環(huán)，再用三條彈性膠帶固定手術(shù)膠帶，將環(huán)連接到頭頂?shù)臋M桿上，并且橫桿的高度需要調(diào)節(jié)以使動(dòng)物后腿被抬高到籠子的地板之上且頭朝下傾斜30 °，人為的造成動(dòng)物失重或者模擬失重狀態(tài)，使骨質(zhì)水平降低，鈣磷代謝處于負(fù)平衡，最終導(dǎo)致骨質(zhì)丟失。后肢懸吊廢用可引起DNMT1的上調(diào)和啟動(dòng)因子H19的高甲基化，這導(dǎo)致了lncRNA-H19的下調(diào)和ERK信號(hào)的抑制[13]。Paiva等[14]的研究表明在正常大鼠和尾部懸吊致DOP大鼠的骨愈合中，骨量減少不影響骨愈合過(guò)程，無(wú)論骨折是否骨質(zhì)減少，時(shí)間都是一個(gè)獨(dú)立的決定因素。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在最初廢用期后和隨后廢用期后采用中等強(qiáng)度的阻力訓(xùn)練并不能改善DOP嚴(yán)重程度[15]。目前該模型在藥物(特別是中醫(yī)藥)抗DOP的作用和作用機(jī)理方面應(yīng)用廣泛[16]。

2.2 腿尾固定模型

具體造模方法為，消毒后的0.1 mm醫(yī)用鋼絲穿過(guò)后肢一側(cè)踝部松緊適宜地固定到距肛門1～2 cm尾根處，一般4周即可造成DOP動(dòng)物模型[17]。唐學(xué)陽(yáng)等[18]為研究DOP對(duì)維生素D受體表達(dá)的關(guān)系，使用此法將大鼠分別固定2周和4周，采用免疫組織化學(xué)和圖象分析方法檢測(cè)固定對(duì)DOP大鼠模型VDR表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼鼠固定側(cè)肢體骨VDR表達(dá)的增強(qiáng)與固定有關(guān)。成勇等[19]對(duì)此模型進(jìn)行了改進(jìn)，即在距大鼠肛門1 cm的尾根部纏繞醫(yī)用膠帶，以加大鐵絲的受力面積，從而減輕鋼絲對(duì)尾部的壓迫。

2.3 石膏繃帶固定模型

該模型適用于犬、家兔等體積中等的動(dòng)物。造模方法為，使用石膏繃帶將動(dòng)物的一側(cè)后肢包裹2～3層，石膏繃帶每?jī)芍芨乱淮我苑乐故嗫噹蓜?dòng)或肢體發(fā)生壓瘡[20]。馬信龍等[21]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)石膏繃帶固定誘發(fā)DOP模型大鼠脛腓骨在不同時(shí)間點(diǎn)之間的最大負(fù)荷、彈性模量與鈣含量都明顯低于正常大鼠，且馬森染色顯示隨著廢棄時(shí)間推移，膠原蛋白逐漸減少，說(shuō)明DOP是由肌肉不活動(dòng)和負(fù)重減少引起。通過(guò)石膏繃帶固定DOP模型，可以很好地理解骨、關(guān)節(jié)軟骨、肌肉、神經(jīng)和血管的變化。

3 其他類型動(dòng)物模型

3.1 藥物誘發(fā)模型

Chappard等[22]描述了一種使用肉毒桿菌毒素(botulinum toxin, BTX)麻痹大鼠后肢肌肉的模型，以研究廢棄對(duì)骨骼的影響。BTX是一種神經(jīng)毒性蛋白質(zhì)，由肉毒桿菌產(chǎn)生。BTX充當(dāng)?shù)鞍酌?，用于阻隔運(yùn)動(dòng)終板突觸前部分的SNARE復(fù)合體的SNAP-25，從而抑制乙酰膽堿泡?？客挥|前膜。因此，用BTX注射會(huì)使骨骼肌癱瘓，導(dǎo)致注射肢體的固定。但BTX導(dǎo)致的廢用是非永久的，一般情況下注射BTX后4～5 d開(kāi)始癱瘓，8～9 d承重能力部分恢復(fù)。BTX主要用于小鼠、大鼠和兔子，其具體造模方法為，根據(jù)研究的部位而選擇相應(yīng)部位肌肉注射BTX。Vegger等[23]分別對(duì)雌性的16周齡小鼠和44周齡小鼠的同一后肢注射BTX，通過(guò)觀察同一部位骨強(qiáng)度和骨密度，結(jié)果表明幼鼠和老齡鼠的骨量丟失無(wú)顯著差異。該模型為可逆轉(zhuǎn)模型，且在評(píng)價(jià)藥物治療DOP的作用和設(shè)備研究方面應(yīng)用廣泛[24-25]。

3.2 基因工程誘導(dǎo)模型

該造模原理是模擬人體因某種基因突變或表達(dá)異常而發(fā)生DOP，主要通過(guò)對(duì)某些基因的失活、突變或增強(qiáng)表達(dá)，以此來(lái)研究這種基因在DOP發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)理，這有助于DOP的診斷與治療。Akhter等[26]為確定LRP5 G171 V突變是否能防止廢棄相關(guān)的骨量丟失，測(cè)量了野生型、LRP5敲除型和帶有LRP5 G171 V突變型小鼠的骨小梁厚度等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)LRP5敲除型的骨小梁數(shù)量和厚度減少20 %，而LRP5 G171 V突變型減少6 %～11 %。目前證實(shí)的與DOP有關(guān)的基因包括Lrp5、LRP6、LncRNA-H19、Sost、(Cx)37、β連環(huán)蛋白、BCL2等[27-29]。

3.3 冬眠熊模型

冬眠熊模型是研究人DOP的極好模型，因?yàn)槎呤羌∪夤趋缽U棄不用的自然模式，且熊和人類有相似的下肢骨骼形態(tài)，熊能像人類一樣走路。冬眠熊在長(zhǎng)時(shí)間廢用(即冬眠)期間不會(huì)出現(xiàn)DOP[30]。Donahue等[31]將圈養(yǎng)冬眠熊放置在與其體積對(duì)應(yīng)的鋪好稻草的涵洞中，它們?cè)诙咂陂g是不活躍的，觀察4～4.5個(gè)月，發(fā)現(xiàn)熊會(huì)每天進(jìn)行3～4次顫抖(發(fā)抖)。熊的這種顫抖(發(fā)抖)可能足以通過(guò)一種涉及低強(qiáng)度、高頻機(jī)械刺激的機(jī)制來(lái)維持小梁骨量和微結(jié)構(gòu)，因此現(xiàn)在的研究中也有學(xué)者通過(guò)低強(qiáng)度、高頻機(jī)械刺激來(lái)探索對(duì)DOP的作用[32]。由于熊的價(jià)格與飼養(yǎng)成本較高，目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

3.4 聯(lián)合造模法誘發(fā)的DOP模型

DOP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病因素多樣化，因此采用多因素聯(lián)合造模或同一試驗(yàn)中使用兩種以上的造模方法具有很大的意義與應(yīng)用價(jià)值。聯(lián)合造模法還具有造模周期較短，造模效果好等優(yōu)勢(shì)，因而在近年來(lái)應(yīng)用較多。如CIZ基因缺陷型聯(lián)合尾部懸吊法[33]、去卵巢聯(lián)合尾部懸吊法等[34]。Niziolek等[35]在兩種不同的Lrp5 高骨量基因敲入小鼠模型中，利用尾部懸吊法和藥物BTX誘發(fā)法發(fā)現(xiàn)，Lrp5高骨量等位基因提供了顯著的保護(hù)，防止廢棄的再吸收效應(yīng)和雌激素的戒斷，因此，提供了一個(gè)潛在的機(jī)制來(lái)模擬藥物干預(yù)，以防止各種骨浪費(fèi)。

4 討論

DOP動(dòng)物模型為認(rèn)識(shí)DOP的生理病理特點(diǎn)和驗(yàn)證藥物的治療效果提供了一種較為科學(xué)的手段和方法。理想的動(dòng)物模型設(shè)計(jì)應(yīng)符合相似性、方便性、關(guān)聯(lián)性和適宜性的原則。目前各類模型動(dòng)物各有特點(diǎn)，造模的方法也各有側(cè)重，因此所制作的模型動(dòng)物往往只能在某些方面如病因、臨床癥狀或病理變化表現(xiàn)出DOP的特征。

去勢(shì)法造模通過(guò)手術(shù)的方法切斷脊髓或神經(jīng)從而達(dá)到局部廢用而產(chǎn)生DOP，固定法造模通過(guò)非手術(shù)方法固定局部肢體或使肢體失重達(dá)到廢用效果而產(chǎn)生DOP，一般來(lái)說(shuō)手術(shù)造模產(chǎn)生DOP的速度要快于非手術(shù)方法[36]。這兩類造模多適用于藥物的研發(fā)；尾部懸吊誘發(fā)的DOP動(dòng)物模型為應(yīng)用最廣泛的造模方法之一，雖然此法常易使模型鼠尾部潰爛，但其對(duì)骨骼廢用過(guò)程中抑制和恢復(fù)骨形成所需的時(shí)間較短且可預(yù)測(cè)，還可對(duì)同一動(dòng)物的廢用骨骼和正常骨骼進(jìn)行直接比較，因此，該模型有助于研究體內(nèi)骨形成的調(diào)節(jié)因素；藥物BTX造模法操作簡(jiǎn)單且具有可逆性，可模擬急性廢用產(chǎn)生的DOP。但應(yīng)認(rèn)識(shí)到BTX具有很強(qiáng)的不良反應(yīng)，BTX中的肉毒桿菌毒素底物-1可以降解骨骼中的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物且參與了破骨細(xì)胞的分化通路[37]，這可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；基因工程造模法是近年來(lái)隨著基因研究的深入而逐漸發(fā)展起來(lái)的一種新興造模方法，可從基因?qū)用嫣剿鱀OP與基因的關(guān)系從而達(dá)到精準(zhǔn)治療，但由于基因工程造模操作難度系數(shù)和費(fèi)用較高[38]，目前該領(lǐng)域的相關(guān)研究較少；冬眠熊與人類有相似的下肢骨骼系統(tǒng)，但長(zhǎng)時(shí)間廢用(冬眠)而不會(huì)產(chǎn)生DOP，因此研究冬眠熊的骨代謝機(jī)制可為治療人類DOP提供有價(jià)值的見(jiàn)解。但由于我國(guó)地理位置原因，冬眠熊資源短缺，獲取成本高，未曾發(fā)現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

我們應(yīng)該認(rèn)識(shí)到動(dòng)物與人類在骨質(zhì)構(gòu)造方面存在差異，因此只能間接的模擬人類疾病，而不能完全替代人類疾病，只有在動(dòng)物模型與人類DOP發(fā)病機(jī)制和病例特點(diǎn)相似的情況下，DOP動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)才有借鑒意義。隨著人們對(duì)DOP研究的深入，DOP建模方法及評(píng)價(jià)方法也在不斷完善，人們認(rèn)識(shí)到DOP可能是由多因素引起，因此采用聯(lián)合造模方法反而更能模擬出與人類DOP發(fā)病機(jī)制相似的動(dòng)物模型且更貼近于臨床實(shí)際，未來(lái)還需進(jìn)行更多的研究甚至進(jìn)行動(dòng)物循證學(xué)的研究來(lái)證明其優(yōu)越性。