趙元 李香斌 張尚斌 陳劍平*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518033

2. 深圳市中醫(yī)院/深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點實驗室，廣東 深圳 518033

3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518172

2 型糖尿病性骨質(zhì)疏松(type 2 diabetic osteoporosis，T2DOP)是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，是一種全身性代謝性骨病。T2DOP的發(fā)病率隨糖尿病患者群體的不斷擴大而逐年升高，而中國糖尿病患者骨質(zhì)疏松的發(fā)病率為40%～66%[1]。T2DOP患者因骨脆性和微血管并發(fā)癥導(dǎo)致的微裂紋而極易引起骨折[2]，不僅嚴重影響患者生活質(zhì)量，而且給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療原則主要為控制原發(fā)病和補充鈣劑及維生素D[3]，但效果不顯著。中醫(yī)藥作用的多靶點性在臨床治療多因素影響的復(fù)雜的T2DOP有一定的優(yōu)勢。在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中，T2DOP屬于“消渴”合并“骨痿”范疇，腎虛和脾虛是其重要病機[1]。山藥和黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》并列為上品，山藥，補脾養(yǎng)陰，生津益肺，強腎固精；黃芪，補氣升陽，益水之源，生津養(yǎng)血。二藥相配補脾固腎，益氣生津，二者一陰一陽，相互促進，一則使脾氣升，散精達肺，輸布津液以止渴，二則使腎氣固，封藏精微以生髓，且山藥長肌肉堅強筋骨，治療“消渴”并“骨痿”有標(biāo)本兼治的效果。二者均是糖尿病合并骨質(zhì)疏松的常用藥物[4～6]，且現(xiàn)代藥理研究[7]顯示山藥能通過調(diào)控Wnt和p38信號通路而具有抑制骨丟失作用，作為PPARγ的激動劑、AMPK激活劑而治療2 型糖尿病[8]。黃芪甲苷通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/FoxO1通路抑制糖尿病大鼠肝糖異生[9-10]，黃芪多糖可直接促進成骨細胞質(zhì)增殖、提高成骨細胞活性[11]，但二者配伍治療T2DOP的作用機制卻未見研究。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的方法探討黃芪和山藥配伍治療T2DOP的作用機制，為日后兩者配伍治療T2DOP研究提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1“山藥-黃芪”藥對化學(xué)成分：在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索山藥、黃芪對應(yīng)的化學(xué)成分，篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability, OB)>30%且類藥性(drug likeness, DL)>0.18。

1.1.2T2DOP疾病相關(guān)基因：以“Type 2 diabetic osteoporosis”為關(guān)鍵詞，在Gene cards和 OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索T2DOP相關(guān)基因，去除重復(fù)靶點，匯總得到與T2DOP相關(guān)的疾病靶點。

1.1.3“山藥-黃芪”藥對的活性成分靶標(biāo)：在TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)及Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch)數(shù)據(jù)庫中查詢1.1.1中所得化學(xué)成分的預(yù)測靶標(biāo)。并在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)中將預(yù)測靶標(biāo)轉(zhuǎn)換為基因名，獲得靶點的Uniprot ID。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建“山藥黃芪化學(xué)成分-山藥黃芪候選靶標(biāo)-T2DOP相關(guān)靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)：利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“化學(xué)成分-預(yù)測靶標(biāo)-T2DOP相關(guān)靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)，利用 Cytoscape軟件中Network Analyzer插件進行網(wǎng)絡(luò)分析，并獲取網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，篩選大于度中心性、接近中心性、中介中心性/中間中心性三者均值的節(jié)點。

1.2.2基因功能估計分析：將篩選節(jié)點中的靶標(biāo)通過David 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行GO生物學(xué)富集分析，包括生物過程(biological process, BP)，分子功能(molecular function, MF)和細 胞 組 成(cellular component, CC)3 個部分，設(shè)定閾值P<0. 05，結(jié)果以氣泡圖形式進行可視化展示。

1.2.3KEGG富集分析及可視化：運用R語言軟件對關(guān)鍵靶點進行信號通路富集分析，挑選與T2DOP相關(guān)的信號通路，最終設(shè)定閾值P<0. 05。

1.2.4“山藥黃芪化學(xué)成分-關(guān)鍵作用靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：利用Cytoscape 3.7.1軟件將1.2.1中得到的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點及1.2.3中富集的信號通路構(gòu)成“山藥黃芪化學(xué)成分-關(guān)鍵作用靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)，通過計算該網(wǎng)絡(luò)的拓撲特征值，判斷山藥黃芪治療T2DOP的關(guān)鍵化學(xué)成分、作用靶標(biāo)及信號通路。

2 結(jié)果

2.1 “山藥-黃芪”藥對中活性組分的篩選

在TCMSP中查詢到符合篩選條件的山藥活性成分16 個、黃芪20 個，最終共篩選出36個化合物，見表1。

表1 “山藥-黃芪”藥對的候選活性成分信息

2.2 T2DOP疾病靶基因的篩選結(jié)果

在Gene cards網(wǎng)站收集得到T2DOP疾病靶標(biāo)共3 180 個，OMIM網(wǎng)站收集得到183 個T2DOP靶標(biāo)，合并2 個數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，剔除重合基因，共檢索出3 305 個相關(guān)基因信息。

2.3 “山藥-黃芪”藥對中活性成分的靶標(biāo)預(yù)測

將篩選出的36 個成分分別在TCMSP平臺和Swiss Target Prediction網(wǎng)站中查詢預(yù)測的靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將蛋白靶點轉(zhuǎn)化為靶點基因，其中山藥16 個成分，370 個靶基因；黃芪20 個成分，547 個靶基因，最終共有36 個化合物，去除重復(fù)靶基因后共698條靶基因信息。

2.4 “山藥黃芪化學(xué)成分-山藥黃芪候選靶基因-T2DOP相關(guān)靶基因”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“山藥黃芪化學(xué)成分-山藥黃芪候選靶基因-T2DOP相關(guān)靶基因”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點之間相互作用，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，共512個節(jié)點，以大于該網(wǎng)絡(luò)的度中心性均值7.286 0、接近中心性0.316 8、中介中心性/中間中心性均值0.004 1為篩選條件篩選出關(guān)鍵節(jié)點67 個，其中含有靶標(biāo)40 個，MET，CYP19A1，AR，PTGS1，ADORA2A，PTGS2，CDK2，GSK3B，NCOA2，ESR2，KDR，ESR1，PTPN1，SRC，RXRA，EGFR，CASP3，GABRA1，CCNA2，PARP1，CA2，ALOX12，PGR，ADRB2，NOS2，PPARG，SYK，ABL1，MAPK14，CCNB1，BACE1共31 個靶標(biāo)為T2DOP疾病靶基因，此外尚有ACHE、ADORA1、ADRA1B、CA14、CA9、CDK1、CHRM1、HSD17B2、MAOB 9 個關(guān)鍵靶標(biāo)。

2.5 GO 功能分析結(jié)果

使用David 6.8數(shù)據(jù)庫對山藥黃芪治療T2DOP的40 個關(guān)鍵靶點進行GO富集分析，篩選P<0.05的條目，共有87 個GO生物學(xué)條目，其中有56 個BP條目，21 個MF條目，10 個CC條目，生物過程包括肽基絲氨酸磷酸化、調(diào)節(jié)細胞增殖、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、視黃酸的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、子宮內(nèi)胚胎發(fā)育、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、凋亡過程的負調(diào)控等；分子功能涉及ATP結(jié)合、鋅離子結(jié)合、類固醇激素受體活性、序列特異性DNA結(jié)合、碳酸鹽脫水酶活性等。富集于細胞核、細胞膜、細胞溶質(zhì)、細胞質(zhì)核周區(qū)域、高爾基體、質(zhì)膜胞質(zhì)側(cè)的外源成分、受體復(fù)合體、核染色質(zhì)、細胞連接、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等區(qū)域。見圖2～圖4。

圖2 “山藥-黃芪”抗T2DOP潛在靶點生物過程的GO分析前10 位

圖3 山藥-黃芪抗T2DOP潛在靶點分子功能的GO分析

圖4 山藥-黃芪抗T2DOP潛在靶點細胞組分的GO分析

2.6 KEGG信號通路富集分析與化合物-靶點-通路互相作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用R語言對40 個關(guān)鍵靶標(biāo)基因進行KEGG 通路分析。在通路富集分析中，得到102條信號通路，其中與T2DOP相關(guān)的17 條通路，分別為VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、甲狀腺素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、催乳素信號通路(prolactin signaling pathway)、細胞衰老(cellular senescence)、卵巢類固醇生成(ovarian steroidogenesis)、血小板活化(platelet activation)、黏著斑(focal adhesion)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、脂肪細胞中脂解的調(diào)節(jié)(regulation of lipolysis in adipocytes)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、鈣信號通路(calcium signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、花生四烯酸代謝(arachidonic acid metabolism)。見圖5。

將篩選出的68 個節(jié)點及17 條T2DOP相關(guān)的KEGG通路導(dǎo)入Cytoseape軟件構(gòu)建“化合物-靶基因-信號通路”互相作用網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“山藥-黃芪”藥對中化學(xué)成分所對應(yīng)的靶點與通路，見圖5。網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點之間相互作用，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，共84 個節(jié)點，該網(wǎng)絡(luò)的度中心性均值26.928 6、接近中心性0.442 4、中介中心性/中間中心性均值0.015 8的2倍為篩選條件篩選出關(guān)鍵節(jié)點28 個，其中含有靶標(biāo)15 個，均為T2DOP疾病靶基因，按度值排序為CDK2、PTGS2、PTGS1、GSK3B、SRC、CYP19A1、EGFR、ESR1、ESR2、AR、MAPK14、ADORA2A、NCOA2、KDR、NOS2；13 個節(jié)點為化合物，按度值排序依次為山奈酚、異鼠李素、槲皮素、(6aR,11aR)-3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、7-O-甲基異戊醇、3,9-di-O-美迪紫檀素、海風(fēng)藤烯酮、芒柄花黃素、熊竹素、毛蕊異黃酮、異黃烷酮、蓽茇明寧堿、(3R)-3-(2-hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol。文獻研究表明，山奈酚[12-13 ]對2 型糖尿病及骨質(zhì)疏松均有調(diào)節(jié)作用，槲皮素[14]具有降糖作用，異鼠李素[15]可能抑制經(jīng)典NF-κB通路對破骨細胞的分化具有抑制作用, 毛蕊異黃酮、芒柄花黃素可通過調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的表達促進成骨細胞的成骨作用[16]，說明山奈酚、異鼠李素、槲皮素等13 個化合物可能是山藥黃芪藥對發(fā)揮抗T2DOP的活性化合物。度值排前三位的信號通路分別為PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路及雌激素信號通路，說明這些信號通路在調(diào)節(jié)T2DOP中起關(guān)鍵作用。

圖5 “山藥-黃芪”藥對治療T2DOP的 KEGG 信號通路分析

圖6 “山藥-黃芪”藥對中化學(xué)成分所對應(yīng)的靶點與通路

3 討論

2 型糖尿病(T2DM)是一種以缺乏胰島素和高糖為特征的慢性代謝性疾病，占糖尿病患者的90%以上，可引起骨質(zhì)疏松，導(dǎo)致T2DOP。T2DOP在T2DM并發(fā)癥中病發(fā)率最高可達60%[17-18]，西醫(yī)主要以對癥治療為主，然而糖尿病合并骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制比較復(fù)雜，早期癥狀不明顯，部分降糖西藥亦會影響到骨密度[19-20]，使其在防治中加大了難度。中醫(yī)藥作用的多靶點性在臨床治療復(fù)雜發(fā)病機制的T2DOP方面有一定的優(yōu)勢，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的連接和關(guān)系分析為基礎(chǔ)構(gòu)建“化學(xué)成分-預(yù)測靶標(biāo)-信號通路”的多層次網(wǎng)絡(luò)，然后綜合分析中藥復(fù)方的作用，既反映了中藥復(fù)方多成分、多靶點、多通路的特點，又與疾病結(jié)合起來，與中醫(yī)整體觀、辨證論治的基本原則相吻合。

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫，山藥-黃芪藥對中含有OB>30 %且DL>0.18 %的化學(xué)成分36個，經(jīng)過進一步檢索得到預(yù)測作用靶點698 個，T2DOP共得到3 305 個相關(guān)靶點，山藥黃芪化學(xué)成分-山藥黃芪候選靶基因與T2DOP相關(guān)靶標(biāo)作用網(wǎng)絡(luò)圖中以大于該網(wǎng)絡(luò)的度中心性、接近中心性、中介中心性/中間中心性均值為篩選條件篩選出關(guān)鍵節(jié)點67 個，其中含有靶標(biāo)40 個。以40 個靶標(biāo)進行GO分析及KEGG 通路分析，結(jié)果表明，GO分析中有56個BP條目，10 個CC條目，21 個MF條目，結(jié)果表明山藥-黃芪藥對主要調(diào)節(jié)肽基絲氨酸磷酸化、調(diào)節(jié)細胞增殖、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、視黃酸的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)控、子宮內(nèi)胚胎發(fā)育、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、凋亡過程的負調(diào)控等生物過程。通路富集分析表明，主要影響對糖尿病和骨質(zhì)疏松均有調(diào)節(jié)作用的卵巢類固醇生成及雌激素信號通路、糖尿病相關(guān)信號通路(松弛素信號通路、黏著斑、催乳素信號通路、甲狀腺素信號通路、內(nèi)分泌抵抗、血小板活化[21]、FoxO信號通路[22])、與骨質(zhì)疏松成骨作用相關(guān)的作用通路(脂肪細胞中脂解的調(diào)節(jié)、VEGF信號通路、p53信號通路、IL-17信號通路)、與骨質(zhì)疏松破骨作用相關(guān)的信號通路(鈣信號通路、細胞衰老、花生四烯酸代謝)、與骨質(zhì)疏松骨成骨作用破骨作用均具有調(diào)節(jié)作用的PI3K-Akt信號通路[23-24]等。

這與文獻調(diào)研[25]不謀而合，雌激素可通過胰島β細胞中的雌激素受體促進胰島細胞存活，脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和胰島素的生物合成和分泌；雌激素同時是骨骼代謝的主要激素調(diào)節(jié)劑，雌激素缺乏會增強骨吸收，導(dǎo)致骨重建失衡，還可促進骨形成，提高骨密度，對糖尿病及骨質(zhì)疏松均具有較好的調(diào)節(jié)作用。糖尿病從多方面影響骨的形成以及骨吸收過程，誘發(fā)骨質(zhì)疏松，因此，干預(yù)糖尿病的發(fā)展可減緩骨質(zhì)疏松的發(fā)展。研究報道，松弛素信號通路[26]、黏著斑[27]、催乳素信號通路[28]、甲狀腺素信號通路[29]對糖尿病均具有調(diào)節(jié)作用。骨代謝的穩(wěn)態(tài)取決于成骨細胞誘導(dǎo)的骨形成和破骨細胞誘導(dǎo)的骨吸收之間的平衡。糖尿病性骨質(zhì)疏松主要是由于成骨細胞和破骨細胞之間的不平衡導(dǎo)致骨形成減少，骨密度和骨強度受損，以及骨微結(jié)構(gòu)的破壞。強化和恢復(fù)成骨細胞的成骨分化，重新平衡成骨細胞和破骨細胞的數(shù)量，可能有助于治療糖尿病性骨質(zhì)疏松癥，如雙歧曲霉多糖引起抗骨質(zhì)疏松作用的機制是由VEGF和OPG的上調(diào)介導(dǎo)的[30]；p53抑制成骨細胞增殖并增強成骨細胞凋亡，從而減少骨形成[31]；IL-17在骨質(zhì)流失中起重要作用，IL-17促進了骨形成負調(diào)節(jié)劑硬化蛋白基因誘導(dǎo)的脂肪形成，并增強了對成骨的抑制作用[32]；NFATc1是破骨細胞分化的主要轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控許多破骨細胞的特異功能基因，RANKL激活鈣信號通路，是激活NFATc1所必需的[33]；說明VEGF信號通路、p53信號通路、IL-17信號通路等主要影響成骨作用，鈣信號通路等主要調(diào)節(jié)破骨細胞的功能。

綜上所述，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法探討山藥-黃芪藥對治療T2DOP的可能作用靶標(biāo)及途徑，并建立“山藥黃芪藥對化學(xué)成分-靶標(biāo)基因-信號通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，揭示了山藥黃芪藥對治療T2DOP的多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中起主要作用的化學(xué)成分可能為山奈酚、異鼠李素、槲皮素、(6aR,11aR)-3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、7-O-甲基異戊醇、3,9-di-O-美迪紫檀素、海風(fēng)藤烯酮、芒柄花黃素、熊竹素、毛蕊異黃酮、異黃烷酮、蓽茇明寧堿、(3R)-3-(2-hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol 共13 個化合物，山藥黃芪藥對治療T2DOP的靶標(biāo)可能主要為CDK2、PTGS2、PTGS1、GSK3B、SRC、CYP19A1、EGFR、ESR1、ESR2、AR、MAPK14、ADORA2A、NCOA2、KDR、NOS2 共15 個靶標(biāo)，度值相對較高的信號通路為PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路及雌激素信號通路，最終達到調(diào)節(jié)T2DOP的作用。