張陸 劉志昂 姜巖 劉軍

鄭州人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003

膝骨關(guān)節(jié)炎為一種退行性病變，臨床表現(xiàn)為緩慢發(fā)展的膝關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、僵硬、關(guān)節(jié)腫脹、活動受限和關(guān)節(jié)畸形等。隨著人口老齡化的不斷加劇，膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率不斷增高，目前尚無有效的治療方法。臨床上常用的治療方法是通過關(guān)節(jié)腔注射潤滑劑或應(yīng)用非甾體抗炎藥，以緩解患者的痛疼及相關(guān)癥狀，晚期患者可以采取關(guān)節(jié)置換等手術(shù)治療[1]。盡管如此，還是不能對軟骨損傷及炎癥進(jìn)程進(jìn)行逆轉(zhuǎn)[1]。干細(xì)胞抑制治療是骨關(guān)節(jié)炎的一種新的治療手段。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)為一種多能干細(xì)胞，自我更新和多向分化能力強，可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞[2]。骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是研究較早的一種MSCs，但是由于來源有限且取材具有侵襲性，已被其他來源MSCs逐漸取代。hUC-MSCs具有分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題限制的特征，有可能成為BMSCs的理想替代物[3]。iPSC-MSCs是一種新型干細(xì)胞，是成熟體細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄重編、培養(yǎng)、擴(kuò)增誘導(dǎo)成的MSCs，相對于傳統(tǒng)的干細(xì)胞，其增殖潛能更大，可能是一種很有前途的替代細(xì)胞來源[4]。因此，本研究將基于動物實驗，探討iPSC-MSCs與hUC-MSCs對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的治療作用及可能機制，為臨床干細(xì)胞移植治療骨關(guān)節(jié)炎提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SD大鼠50只，雌雄各半，重量為170 ～210 g，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYDWXK(豫)2018-011，合格證號：344002837650。

1.1.2藥品與試劑：iPSC-MSCs由河南金泰生物技術(shù)股份有限公司提供，IPMC批號：2018110432，規(guī)格：4×108個細(xì)胞/mL；hUC-MSCs由河南金泰生物技術(shù)股份有限公司提供，批號：UMC2018091466，規(guī)格：4×108個細(xì)胞/mL，經(jīng)鑒定iPSC-MSC與hUC-MSCs均為第3代次細(xì)胞；玻璃酸鈉注射液由華煕福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號：20181085H，規(guī)格：25 mg:2.5 mL/支；抗MMP-13多克隆抗體、抗CollagenⅡ多克隆抗體、抗ADAMTS-5多克隆抗體均由Abcam公司提供，批號分別為ab1846、ab1890、ab1822。

1.2 方法

1.2.1膝骨關(guān)節(jié)炎模型的建立：SD大鼠禁食12 h后采用Hulth法建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型。將大鼠麻醉后仰臥于臺上，對右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)進(jìn)行常規(guī)消毒，在髕骨旁的內(nèi)側(cè)將膝關(guān)節(jié)切開，顯露，將內(nèi)側(cè)副韌帶切斷后將關(guān)節(jié)腔進(jìn)行打開；將內(nèi)側(cè)的半月板切除；在手術(shù)中保證關(guān)節(jié)面沒有受到損傷。止血后對切口進(jìn)行縫合。假手術(shù)組不切斷前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶及半月板。術(shù)后每只大鼠給予肌注青霉素20萬IU，1次/d，共3 d。術(shù)后1周，對每只大鼠進(jìn)行運動訓(xùn)練，加重膝骨關(guān)節(jié)炎。

1.2.2分組與給藥：按照隨機數(shù)字法將50只SD骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠分為模型組、iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組、玻璃酸鈉組、假手術(shù)組，每組10只。模型組與假手術(shù)組通過關(guān)節(jié)腔注射50 μL的生理鹽水；iPSC-MSCs組與hUC-MSCs組分別通過關(guān)節(jié)腔注射50 μL(2×106個細(xì)胞/mL)的iPSC-MSCs (4×108個細(xì)胞/mL)與hUC-MSCs (4×108個細(xì)胞/mL)；玻璃酸鈉組通過關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉注射液，50 μL/次，1次/周，共5次。將所有大鼠在給藥5周后予以處死。

1.2.3觀察指標(biāo)：①膝關(guān)節(jié)直徑差值：采用游標(biāo)卡尺對術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)與對側(cè)膝關(guān)節(jié)的直徑進(jìn)行測量，計算差值；②膝關(guān)節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級的評價：給藥1周后，對每組大鼠術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行X線檢查，采用Kellgren-Lawrence分級評分系統(tǒng)評價膝骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，從輕到重分為：0級(正常的膝關(guān)節(jié))、I級、II級、III級、IV級(最嚴(yán)重程度的膝骨關(guān)節(jié)炎)；③膝關(guān)節(jié)Pelletier評分：處死大鼠后取其膝關(guān)節(jié)，在顯微鏡下對關(guān)節(jié)腔內(nèi)的軟骨退變情況進(jìn)行觀察，進(jìn)行膝關(guān)節(jié)Pelletier評分，評分越高表示軟骨受到損傷的程度就越高；④膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)評分：處死大鼠后取其股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面，經(jīng)處理后采用Mankin標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理組織學(xué)評分，評分越高表示軟骨結(jié)構(gòu)受到破壞的程度就越高；⑤MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5水平的檢測：處死大鼠后取其膝關(guān)節(jié)，采用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠膝關(guān)節(jié)MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組膝關(guān)節(jié)直徑差值的比較

與假手術(shù)組比較，模型組的膝關(guān)節(jié)直徑差值[(2.45±0.62) mm]明顯增大，膝關(guān)節(jié)發(fā)生變形，說明膝骨關(guān)節(jié)炎模型建立成功。iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組的膝關(guān)節(jié)直徑差值分別為(1.10 ±0.38) mm、(1.29 ±0.46) mm、(1.50±0.35) mm，與模型組比較，均明顯降低(P<0.05)；iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組之間的的膝關(guān)節(jié)直徑差值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組膝關(guān)節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級的比較

與假手術(shù)組比較，模型組膝關(guān)節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級明顯降低(P<0.05)；iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組的膝關(guān)節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級均明顯優(yōu)于模型組(P<0.05)，iPSC-MSCs組的膝關(guān)節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級明顯優(yōu)于hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組(P<0.05)，hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組膝關(guān)節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級情況

2.3 各組膝關(guān)節(jié)Pelletier評分的比較

與假手術(shù)組比較，模型組的膝關(guān)節(jié)Pelletier評分[(3.35±0.77)分]明顯增高(P<0.05)；iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組的膝關(guān)節(jié)Pelletier評分分別為(1.19±0.53)分、(2.08±0.60)分、(1.99±0.59)分，與模型組比較，均明顯降低(P<0.05)；iPSC-MSCs組的膝關(guān)節(jié)Pelletier評分均明顯低于hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組(P<0.05)，hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)評分的比較

各組膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)檢測結(jié)果見圖1。假手術(shù)組、iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組膝關(guān)節(jié)的骨組織表現(xiàn)正常，軟骨細(xì)胞呈較為均勻地分布，潮線表現(xiàn)為完整且平滑；模型組膝關(guān)節(jié)的軟骨邊緣出現(xiàn)部分缺損，軟骨細(xì)胞成簇分布，排列比較紊亂，可見炎性細(xì)胞浸潤，潮線漂移。

圖1 各組膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)檢測結(jié)果 (HE染色×100)

與假手術(shù)組比較，模型組的膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)評分[(5.46±1.33)分]明顯增高(P<0.05)；iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組的膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)評分分別為(1.80±0.47)分、(3.32±1.15)分、(3.90±1.20)分，與模型組比較，均明顯降低(P<0.05)；iPSC-MSCs組的膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)評分均明顯低于hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組(P<0.05)，hUC-MSCs組與玻璃酸鈉組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 各組MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5水平的比較

與假手術(shù)比較，模型組的CollagenⅡ水平明顯降低(P<0.05)，MMP-13與ADAMTS-5水平均明顯升高(P<0.05)。iPSC-MSCs組、hUC-MSCs組及玻璃酸鈉組的CollagenⅡ水平明顯高于模型組(P<0.05)，MMP-13與ADAMTS-5水平均明顯低于模型組(P<0.05)；iPSC-MSCs組的CollagenⅡ水平明顯高于hUC-MSCs組及玻璃酸鈉組(P<0.05)，MMP-13與ADAMTS-5水平均明顯低于hUC-MSCs組及玻璃酸鈉組(P<0.05)；hUC-MSCs組的CollagenⅡ水平明顯高于玻璃酸鈉組(P<0.05)，兩組之間MMP-13與ADAMTS-5水平的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5表達(dá)水平的比較

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生缺失、關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)發(fā)生降解等為主要特征的一種退行性關(guān)節(jié)疾病，其病理生理機制比較復(fù)雜，大多數(shù)學(xué)者[5]認(rèn)為是機械性與生物性因素共同作用的結(jié)果。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及基質(zhì)的合成與降解發(fā)生紊亂，是造成膝骨關(guān)節(jié)炎的重要關(guān)鍵[6]。Hulth法是建立膝骨關(guān)節(jié)炎動物模型的經(jīng)典方法，膝骨關(guān)節(jié)炎動物模型的特點與人自發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎的病理生理比較相似[7]，因此常被用于動物基礎(chǔ)實驗研究。

hUC-MSCs具有較高的分化潛能，可向多個方向進(jìn)行分化。有報道[8]指出，從人臍帶中分離出的MSCs，其細(xì)胞含量、增殖能力優(yōu)于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便、無倫理學(xué)爭議等優(yōu)點，越來越受到研究工作者們的關(guān)注。iPSCs是通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子將終末分化的體細(xì)胞重編程為的多能性干細(xì)胞，iPSCs技術(shù)可以用患者自己的體細(xì)胞制備專有的干細(xì)胞，從而大大降低了免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的可能性[9]。iPSC-MSCs的岀現(xiàn)，在干細(xì)胞、表觀遺傳學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域都引起了強烈的反響，使人們對多能性的調(diào)控機制有了突破性的新認(rèn)識，進(jìn)一步拉近了干細(xì)胞與臨床疾病治療之間的距離[10]。

本文基于動物實驗，探討iPSC-MSCs與hUC-MSCs對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的治療作用及可能機制。結(jié)果顯示，iPSC-MSCs與hUC-MSCs均能明顯降低膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的膝關(guān)節(jié)直徑差值、膝關(guān)節(jié)Pelletier評分、膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)評分，改善膝關(guān)節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級；iPSC-MSCs組膝關(guān)節(jié)Pelletier評分、膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)評分均明顯低于hUC-MSC組，膝關(guān)節(jié)腔Kellgren-Lawrence分級明顯優(yōu)于hUC-MSC組。說明iPSC-MSCs與hUC-MSCs能夠?qū)πg(shù)后關(guān)節(jié)不穩(wěn)起到明顯的緩解作用，有效地保護(hù)膝關(guān)節(jié)面之間摩擦而引起的骨質(zhì)增生和硬化；能夠?qū)﹃P(guān)節(jié)腔結(jié)構(gòu)、減少骨贅形成和骨質(zhì)硬化起到明顯的改善作用；能夠明顯減少軟骨層缺損，改善潮線完整度，修復(fù)后的軟骨具有與正常軟骨相似的典型透明特征。提示，iPSC-MSCs與hUC-MSCs均對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎具有明顯的治療作用，iPSC-MSCs優(yōu)于hUC-MSCs。

CollagenⅡ主要由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生，是一種高分子蛋白質(zhì)，絲狀的膠原蛋白纖維與彈性蛋白及多糖蛋白相互交織形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生一定的機械強度[11]；MMP-13可降解多種軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分，能作用于CollagenⅡ，MMP-13水平增高可促進(jìn)其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生裂解，造成關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生缺損[12-13]；ADAMTS-5能夠通過對aggrecan(一種關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的組成成分，對保持軟骨的彈性及完整性具有重要作用)進(jìn)行降解而損傷軟骨結(jié)構(gòu)的完整性及關(guān)節(jié)功能，與膝骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)性[14-15]。本研究中，iPSC-MSCs與hUC-MSCs均能明顯增高膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的CollagenⅡ水平，降低MMP-13與ADAMTS-5水平，而iPSC-MSCs組的CollagenⅡ水平明顯高于hUC-MSCs組、MMP-13與ADAMTS-5水平明顯低于hUC-MSCs組，說明iPSC-MSCs與hUC-MSCs均上調(diào)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中CollagenⅡ的表達(dá)水平，下調(diào)MMP-13與ADAMTS-5的表達(dá)水平，抑制軟骨的降解，起到保護(hù)軟骨的作用，而iPSC-MSCs優(yōu)于hUC-MSCs。

綜上所述，iPSC-MSCs與hUC-MSCs對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎具有明顯治療作用，iPSC-MSCs優(yōu)于hUC-MSCs，其作用機制可能與上調(diào)CollagenⅡ水平及下調(diào)MMP-13、ADAMTS-5水平有關(guān)。