曹新春 郭偉勝

BRAFV600E基因突變型甲狀腺乳頭狀癌（Papillary thyroid cancer，PTC）在所有PTC病例中占40%～80%[1]，具有較高的復(fù)發(fā)率和較低的生存率，預(yù)后較差[2，3]。目前國內(nèi)外公認(rèn)PTC的主要治療方式為甲狀腺部分或完全切除術(shù)，其次通過用放射性131I治療消除殘余甲狀腺癌組織，術(shù)后終身服用甲狀腺激素替代治療，可以使大部分患者的5年生存率提高到97.8%[4]，但同時要面臨手術(shù)并發(fā)癥較多的風(fēng)險。中藥華蟾素是從中華大蟾蜍蟾酥中分離出的天然藥物，具有清熱解毒、消腫、止痛、提高機體免疫力等功能。目前華蟾素在臨床上主要應(yīng)用于肝癌、肺癌、食管癌等腫瘤的綜合治療中，但BRAFV600E基因突變的高風(fēng)險PTC的相關(guān)中醫(yī)藥治療研究中較少。本研究從華蟾素對BRAFV600E基因突變型PTC增殖、遷移、侵襲的影響及其分子機制展開研究，以期揭示華蟾素在BRAFV600E基因突變型PTC的發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為PTC的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司）；NanoDrop 2000（美國Thermo公司）；華蟾素注射液（安徽金蟾生化股份有限公司）；DNase I、RNase A、Trizol（Invitrogen公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶（德國Sigma公司）；CCK-8細(xì)胞檢測試劑盒、Fast-FusionTMClonase（廣州復(fù)能基因有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 所用細(xì)胞為BRAFV600E基因突變型人PTC細(xì)胞B-CPAP，使用添加10%胎牛血清+1%雙抗的RPMI-1640于37℃、相對濕度95%、5% CO2恒溫培養(yǎng)條件下進行常規(guī)培養(yǎng)。將細(xì)胞進行傳代使細(xì)胞的融合度達到80%～90%，根據(jù)細(xì)胞的密度決定傳代的數(shù)量。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞活力檢測 將制備好的細(xì)胞懸液接種到96孔板中，培養(yǎng)2h后加藥處理。分為6個組，所有組均予DMSO，對照組（無其他處理）、20nM華蟾素處理組、0.25nM阿霉素處理組、0.25nM卡鉑處理組、20nM華蟾素+0.25nM阿霉素處理組、20nM華蟾素+0.25nM卡鉑處理組。將6種處理的96孔板分別置于37℃培養(yǎng)箱，于5%CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)24h、48h、72h時分別加入CCK-8溶液10μl，孵育3～4h。在酶標(biāo)儀上測定細(xì)胞的吸光值（450nm波長處）。以上實驗各重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 采用流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinV-FITC/PI聯(lián)合標(biāo)記)檢測細(xì)胞凋亡情況：根據(jù)CCK8細(xì)胞活力檢測結(jié)果，選取適當(dāng)濃度進行后續(xù)試驗，將經(jīng)華蟾素注射液處理48h的實驗組及對照組的B-CPAP細(xì)胞分別收集于離心管中，于室溫下1 000r/min離心5min，棄上清液，用預(yù)冷的PBS洗1次，經(jīng)400目篩網(wǎng)濾過后移入已硅化的玻璃管中，取1×106個細(xì)胞，1 000r/min離心5min，洗滌細(xì)胞，棄上清，加入5μl AnnexinV-FITC染色劑，混勻后避光，室溫孵育15min，上機前5min加入碘化丙啶（PI）染色劑，于4℃下避光染色，4h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 細(xì)胞遷移檢測 采用細(xì)胞劃痕實驗檢測華蟾素對BRAFV600E基因突變型人PTC細(xì)胞B-CPAP遷移能力的影響。首先取細(xì)胞密度約為1×105的細(xì)胞懸液1ml接種于6孔板中，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后加入RPMI-1640培養(yǎng)液，使形成單層細(xì)胞，用10μl無菌槍頭在單層細(xì)胞上垂直劃線，沿壁緩慢加入PBS清洗脫落的細(xì)胞，向?qū)φ战M加入100μl PBS，實驗組加入不同濃度的華蟾素，置于5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，于培養(yǎng)剛開始和培養(yǎng)后48h對細(xì)胞進行觀察拍照。

細(xì)胞遷移率RM=（Wi-Wf）/Wi，RM為細(xì)胞遷移率，Wi為0h劃痕寬度，Wf為48h劃痕寬度。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實驗 采用Transwell實驗檢測華蟾素對B-CPAP細(xì)胞侵襲能力的影響。細(xì)胞進入對數(shù)生長期后，將血清撤除24h，使其饑餓，逐步消除實驗過程中血清可能造成的影響；用PBS對細(xì)胞進行3次洗滌后，使用0.25%胰消化酶處理，消化停止后離心收集細(xì)胞，將培養(yǎng)液上清移除，用PBS洗滌3次，導(dǎo)入2ml無血清培養(yǎng)基，充分制備所需單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×105個/ml；將100μl和500μl不同濃度的華蟾素注射液分別加入上、下室，各組設(shè)定復(fù)孔共3個；將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱，37℃孵育，對小室內(nèi)細(xì)胞進行觀察，培養(yǎng)24h和48h時分別分組將細(xì)胞從小室取出，結(jié)晶紫染色后計數(shù)；小室風(fēng)干之后反轉(zhuǎn)，用倒置顯微鏡顯微觀察，隨機選擇觀察視野5個拍照并計數(shù)，以穿過膜的細(xì)胞數(shù)目來評估細(xì)胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用LSD-t檢驗和單因素方差分析進行數(shù)據(jù)之間的比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素對PTC細(xì)胞的遷移和侵襲影響細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示（見圖1），對照組的RM為0.98±0.069，20nM華蟾素處理后的RM為0.97±0.185，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.124，P=0.912）。Transwell實驗結(jié)果見圖2，對照組的細(xì)胞數(shù)為（476±76）個，華蟾素處理組細(xì)胞數(shù)為（453±46）個，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.5789，P=0.5786）。

圖1 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果

圖2 Transwell實驗結(jié)果

2.2 華蟾素對PTC化療敏感性影響采用CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒對華蟾素干預(yù)后化療藥物阿霉素或卡鉑處理下B-CPAP細(xì)胞的細(xì)胞活力進行檢測。細(xì)胞活力結(jié)果顯示（見表1），20nM華蟾素與0.25nM阿霉素聯(lián)合干預(yù)下的B-CPAP細(xì)胞在72h的OD450值為0.555±0.041，顯著低于阿霉素處理下細(xì)胞的OD450值0.753±0.053（t=5.118，P=0.0069）；而72h的華蟾素與卡鉑聯(lián)合干預(yù)下的B-CPAP細(xì)胞的OD450值為0.620±0.093，與卡鉑處理下細(xì)胞的OD450值0.657±0.070比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.5506，P=0.6112）。華蟾素與卡鉑聯(lián)合干預(yù)下的B-CPAP細(xì)胞在48h的OD450值為0.360±0.056，顯著低于卡鉑處理下細(xì)胞的OD450值0.477±0.012（t=3.538，P=0.024）。以上結(jié)果表明，阿霉素處理下B-CPAP細(xì)胞的活力在華蟾素干預(yù)后顯著降低。

表1 CCK-8檢測華蟾素處理下化療藥物對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞處理后的吸光度值

表1 CCK-8檢測華蟾素處理下化療藥物對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞處理后的吸光度值

組別OD450值（0h）OD450值（24h）OD450值（48h）OD450值（72h）對照組0.231±0.0190.314±0.0120.496±0.0350.837±0.038華蟾素組0.264±0.0310.274±0.0410.598±0.0510.899±0.042阿霉素組0.136±0.0120.261±0.0310.451±0.0470.753±0.053阿霉素+華蟾素組0.241±0.0170.237±0.0470.357±0.0180.555±0.041卡鉑組0.249±0.0140.246±0.0230.477±0.0120.657±0.070卡鉑+華蟾素組0.242±0.0160.267±0.0.350.360±0.0560.620±0.093

2.3 華蟾素對PTC細(xì)胞凋亡的影響華蟾素組B-CPAP細(xì)胞的凋亡率為（14.900±2.858）%，與對照組的細(xì)胞凋亡率（14.400± 0.755）%比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.2930，P=0.7841）；卡鉑聯(lián)合華蟾素組B-CPAP細(xì)胞的凋亡率為（23.800±1.375）%，與卡鉑組的凋亡率（19.370±4.186）%相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.741，P=0.1566）；阿霉素聯(lián)合華蟾素組B-CPAP細(xì)胞的凋亡率為（44.500±1.411）%與阿霉素組的凋亡率（35.470±2.139）%相比顯著上升（t=6.104，P=0.0036）。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

3 討論

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個受多因素共同影響的復(fù)雜過程，與原癌基因的激活，抑癌基因的失活，細(xì)胞增殖與凋亡的動態(tài)平衡被打破等多種生物過程相關(guān)。PTC的發(fā)生和發(fā)展也被證明與基因突變相關(guān)[5，6]。原癌基因BRAF在V600E位點的突變是PTC最常見的突變，占29%～83%[5]。BRAF蛋白是生長信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白激酶RAF激酶家族的成員，參與調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路，促進細(xì)胞生長、分化和抗凋亡。BRAFV600E突變已被證明是一種有效的MAPK激活因子，在包括甲狀腺癌在內(nèi)的多種人類癌癥中均有發(fā)生[7]。多項研究表明，BRAFV600E突變與甲狀腺外擴張、多灶性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期TNM有關(guān)[8]，其不僅增加了腫瘤的侵襲性，而且增加了疾病的復(fù)發(fā)率和死亡率[9]。這些發(fā)現(xiàn)表明BRAFV600E突變型PTC需要更為前瞻性的手術(shù)治療及更謹(jǐn)慎的后續(xù)觀察治療。

中藥華蟾素具有抗癌、清熱解毒、消腫、止痛、提高機體免疫力等功能，同時可刺激骨髓增生，增強機體對放療、化療的耐受性。中醫(yī)角度解釋其：“味辛、氣涼、微毒，入心、肝、脾、肺四經(jīng)”，具有利尿消腫、清熱解毒、軟堅散結(jié)的功效[10]。一項關(guān)于華蟾素聯(lián)合化療治療晚期惡性腫瘤的臨床研究結(jié)果表明，與單純化療相比，華蟾素聯(lián)合治療使治療后骨髓抑制等并發(fā)癥出現(xiàn)的概率顯著降低，臨床效果明顯[11]。本研究中，20nM華蟾素對B-CPAP細(xì)胞的侵襲及遷移無顯著影響，且單獨使用華蟾素處理PTC細(xì)胞，其細(xì)胞活力也無明顯變化；當(dāng)華蟾素與阿霉素聯(lián)合作用于B-CPAP細(xì)胞時，細(xì)胞活力與阿霉素單獨處理時相比顯著降低。除細(xì)胞活力受到抑制之外，華蟾素與阿霉素聯(lián)合干預(yù)對B-CPAP細(xì)胞凋亡也具有顯著影響，與阿霉素單獨處理組相比，聯(lián)合干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率顯著上升。以上結(jié)果表明，華蟾素使得B-CPAP細(xì)胞在阿霉素的處理下活力降低，凋亡增加，即增加了B-CPAP細(xì)胞的化療敏感性。

本研究為中藥華蟾素在BRAFV600E型PTC中的作用情況提供了實驗基礎(chǔ)，但其分子機制仍需進一步的探索，同時，本研究為今后華蟾素在BRAFV600E型PTC的臨床治療中提供了理論支持。