張 熙，粟勝勇，蔡慧倩，覃美相，黃小珍，黃 梅，代 琪，林 安

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸科 南寧 530023)

神經(jīng)根型頸椎病(cervical spondylotic radiculopathy，CSR)是頸椎病的常見類型，約占頸椎病發(fā)病的60%[1]，臨床上以神經(jīng)病理性疼痛為主要表現(xiàn)[2]。研究證實(shí)[3]，神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生的重要原因之一是神經(jīng)細(xì)胞自噬功能紊亂導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和壞死。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)是介導(dǎo)細(xì)胞自噬與凋亡的重要途徑[4]，并且參與了神經(jīng)病理性疼痛的誘發(fā)與維持[5]。ERS作為細(xì)胞的一種保護(hù)機(jī)制，其介導(dǎo)的細(xì)胞自噬可通過細(xì)胞內(nèi)底物的分解代謝參與維持ATP的產(chǎn)生，進(jìn)而回收、降解異常蛋白質(zhì)和細(xì)胞器以維持細(xì)胞代謝平衡，減少細(xì)胞凋亡，修復(fù)受損神經(jīng)[6]，而當(dāng)刺激因素持續(xù)存在導(dǎo)致ERS表達(dá)過強(qiáng)時(shí)，自噬功能出現(xiàn)紊亂將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，加重神經(jīng)病理性疼痛[7,8]。因此，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞自噬水平，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激以減少細(xì)胞凋亡可能是緩解CSR疼痛的關(guān)鍵。

臨床研究證實(shí)[9，10]，采用艾灸療法治療CSR療效確切，具有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，課題組前期研究亦證實(shí)[11]，艾灸療法可通過下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，去除炎性刺激而治療本病，但基于ERS介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡機(jī)制探討艾灸療法緩解CSR神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛機(jī)制研究仍缺乏。因此，本研究通過構(gòu)建CSR大鼠模型，選取大椎穴進(jìn)行溫和灸干預(yù)，觀察其鎮(zhèn)痛效應(yīng)、自噬小體和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)以及ERS標(biāo)準(zhǔn)性蛋白GRP78，ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白Caspase-12、CHOP表達(dá)的變化，探討溫和灸緩解CSR大鼠神經(jīng)病理性疼痛可能的鎮(zhèn)痛機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SD大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量(250±20)g，雌雄各半，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK湘2014-0011)。按照隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠隨機(jī)分為：空白組、模型組、溫和灸組、溫和灸+3MA組4組，每組10只。實(shí)驗(yàn)過程遵照《關(guān)于善待動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》執(zhí)行。

1.2 試劑與儀器

①實(shí)驗(yàn)主要儀器：YLS-3E型痛分析儀(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；離心機(jī)(Eppendorf，Centrifuge 5415D)；電泳儀(北京六一；DYCZ-24DN)；凝膠成像儀(天能，5200)；半干轉(zhuǎn)膜儀(ATTO，WSE-4040)；透射電子顯微鏡(hitachi，日本HT7700)；超薄切片機(jī)(Leica UC7，德國)。

②實(shí)驗(yàn)主要試劑：一抗(Caspase-12：Bioss，BS-1105K；CHOP：Abcam，AB179823；GRP78：索萊寶，K106525P；β-actin：Abcam，AB8227)；山羊抗兔的二抗(北京中杉，ZB2301)；RIPA-PMSF裂解液(索萊寶，R0010)；上樣buffer(索萊寶，P1016)；TBST(索萊寶，T1081)；ECL發(fā)光液(Santa cruz，SC2048)；電鏡固定液(武漢谷歌生物，G1102)；3MA試劑、丙醇、無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法

2.1 造模及造模評價(jià)

①造模方法：除空白組外，其余3組大鼠參照竇夏睿氏法[12]進(jìn)行造模，大鼠用10%水合氯醛按0.35ml/100g劑量腹腔內(nèi)注射麻醉后，俯臥位固定，剃毛備皮充分暴露頸部，常規(guī)消毒后，手觸頸部第二胸椎棘突(T2)，由此向上于背部正中線做約3 cm切口，逐層鈍性分離皮下組織、頸后部肌群，使C6-T2左側(cè)椎弓得到充分暴露，刮凈其表面組織，用顯微鑷輕輕挑開C7和T1，C6和C7椎間隙的黃韌帶和結(jié)締組織，用尖嘴蚊式鉗輕輕鉗開C7左側(cè)椎弓，使脊髓暴露，將脊髓輕推至右側(cè)，再用顯微外科鑷將消毒后的尼龍漁線(直徑0.5 mm，長約1.5 cm)沿脊髓縱軸放至C6-7、T1神經(jīng)根腋下，并避免過度下壓以損傷椎靜脈。操作完畢逐層關(guān)閉縫合傷口。②造模評價(jià)：于每日上午將術(shù)后大鼠放置于觀察箱內(nèi)適應(yīng)周圍環(huán)境30 min后觀察：有無自噬、舔咬、嘶叫等行為[13]；并結(jié)合Kawakami及Dubussion法[14]對大鼠因疼痛攣縮所引起的步態(tài)障礙進(jìn)行評估，1分：大鼠左前肢無畸形，步態(tài)正常；2分：左前肢足內(nèi)收蜷縮畸形，輕微持重或不持重、行走時(shí)跛行；3分：出現(xiàn)顯著的左前肢足內(nèi)收蜷縮畸形，抬起、走動(dòng)時(shí)不著臺面。

2.2 干預(yù)方法

①空白組：正常飼養(yǎng)，不做任何干預(yù)處理；處死時(shí)間同其他組；②模型組：每日抓取1次，予腹腔注射1 mL的生理鹽水，不做溫和灸干預(yù)處理；③溫和灸組：首先予腹腔注射1 mL生理鹽水；其次參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[15]選取大椎穴，刮凈毛發(fā)暴露穴位，選用南陽綠瑩艾草生物制品有限公司出廠的五年純艾條，點(diǎn)燃艾條一端，懸于大鼠大椎穴上方約3 cm處進(jìn)行熏烤，每天1次，每次10 min，以大鼠皮膚出現(xiàn)紅暈為度。

④溫和灸+3MA組：首先腹腔注射1 mL 3MA(15 mg·kg-1生理鹽水稀釋)，其次進(jìn)行溫和灸干預(yù)：操作同溫和灸組。

除空白組外，余3組均于造模成功后的第3天開始干預(yù)，連續(xù)干預(yù)7天后處死。

2.3 樣本采集及指標(biāo)檢測

2.3.1 樣本采集

所有動(dòng)物用10%水合氯醛腹腔注射過量麻醉致死，將壓線處C6-T1段脊髓及神經(jīng)根組織(約1.5 cm*0.5 cm*0.5 cm)取出，根據(jù)脊髓節(jié)段和神經(jīng)根分布分為2份，1份用0.9%冰凍氯化鈉溶液沖洗后放入凍存管，封口，液氮保存，用于Western Blot檢測；1份放入2%戊二醛中固定，4℃冰箱保存，待電鏡檢測。

2.3.2 指標(biāo)檢測

(1)外周神經(jīng)疼痛模型感覺功能的檢測

采用YLS-3E型痛分析儀(廠家：北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)檢測各組大鼠清醒狀態(tài)下的機(jī)械性痛閾。將測痛儀有機(jī)玻璃圓錐體鈍頭，放置于大鼠右后足足趾第3、4跖骨間，線性逐漸增大壓力，當(dāng)大鼠嘶叫掙扎試圖抽回右后足時(shí)儀器自動(dòng)記錄下的壓力值(g)即為大鼠的機(jī)械痛閾[16]。

(2)蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測脊髓及神經(jīng)根組織Caspase-12、CHOP、GRP78的蛋白含量

取30 mg脊髓及神經(jīng)根組織塊置于離心管中，加入200-400μL RIPA-PMSF裂解液將組織充分裂解，4℃下離心5 min，取上清采用BCA法測定蛋白含量。根據(jù)蛋白濃度加入相應(yīng)體積的總蛋白與4×蛋白上樣buffer 100℃變性5-10 min。蛋白電泳：80 V恒壓電泳約20 min，待樣品進(jìn)入分離膠層后，改用100 V恒壓電泳1-1.5 h；轉(zhuǎn)膜：200 mA恒流轉(zhuǎn)膜60-90 min?？贵w孵育：用TBST配制8%脫脂奶粉作為封閉液，將膜放入封閉液中封閉3 h。按抗體說明書上的推薦比例使用封閉液將一抗(Caspase-12，CHOP，GRP78，β-actin)進(jìn)行稀釋，將膜放入稀釋后的一抗中4℃孵育12 h。一抗孵育完成后，使用TBST洗膜3次，每次15 min。將膜放入按1：8000比例稀釋的二抗中37℃孵育1h，使用TBST洗膜3次，每次15 min，使用ECL顯色劑對膜進(jìn)行顯色，于凝膠成像儀中進(jìn)行曝光成像。

(3)透射電子顯微鏡檢測脊髓及神經(jīng)根的自噬小體和超微結(jié)構(gòu)變化

取體積不超過1 mm×1 mm×1 mm脊髓及神經(jīng)根組織塊，經(jīng)1%鋨酸磷酸緩沖液室溫(20℃)再次固定2 h，用酒精和丙酮逐級脫水，純812包埋劑包埋，60℃烤箱聚合48 h后，用超薄切片機(jī)進(jìn)行切片(厚度約60-80 nm)，鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和酒精溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min)，鏡下觀察，采集圖像分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)采用±s表示，多個(gè)樣本間的比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠行為學(xué)比較

造模后，大鼠左前肢出現(xiàn)足內(nèi)收蜷縮、畸形、持重困難、懸空、跛行和舔舐等左前肢保護(hù)現(xiàn)象，與空白組比較，余3組步態(tài)評分明顯升高(P＜0.05)，提示造模成功。干預(yù)后，模型組上述癥狀無明顯變化，步態(tài)評分高于空白組(P＜0.05)；與模型組比較，溫和灸組、溫和灸+3MA組步態(tài)評分顯著降低(P＜0.05)，且溫和灸組下降更為明顯(P＜0.05)，提示溫和灸組能夠更好的改善大鼠步態(tài)障礙(圖1)。

圖1 各組大鼠步態(tài)評分比較(±s，10只鼠/組)

3.2 干預(yù)前后各組大鼠機(jī)械痛閾值比較

干預(yù)前，與空白組比較，模型組、溫和灸組、溫和灸+3MA組大鼠痛閾值明顯降低(P＜0.05)，3組組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。干預(yù)后，與空白組比較，模型組大鼠痛閾值明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較，溫和灸組及溫和灸+3MA組大鼠痛閾值明顯升高(P＜0.05)，且溫和灸組上升較為明顯(P＜0.05)，提示溫和灸組鎮(zhèn)痛效應(yīng)優(yōu)于溫和灸+3MA組(圖2)。

圖2 干預(yù)前后各組大鼠機(jī)械痛閾值比較(±s，10只鼠/組)

3.3 干預(yù)后各組ERS相關(guān)蛋白Caspase-12、CHOP、GRP78表達(dá)的比較

與空白組比較，模型組Caspase-12、CHOP、GRP78蛋白表達(dá)明顯上升(P＜0.05)，提示模型組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生過度表達(dá)，其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被激活。與模型組比較，溫和灸組Caspase-12、CHOP、GRP78蛋?白表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，提示溫和灸可能通過緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，減少細(xì)胞凋亡；溫和灸+3MA組GRP78蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)，Caspase-12、CHOP蛋白表達(dá)有所下降，但差異不具有顯著性(P＞0.05)。與溫和灸+3MA組比較，溫和灸組CHOP蛋白表達(dá)下降明顯(P＜0.05)，Caspase-12、GRP78蛋白表達(dá)有所下降，但差異不具有顯著性(P＞0.05)，表明，加入自噬抑制劑3MA后，ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有所增加。見圖3。

圖3 干預(yù)后各組大鼠ERS相關(guān)蛋白Caspase-12、CHOP、GRP78表達(dá)的比較(10只鼠/組)

3.4 各組大鼠脊髓及神經(jīng)根組織自噬小體及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的比較

透射電子顯微鏡下觀察，可見雙層膜將一小部分細(xì)胞質(zhì)包裹而成的自噬小體；與其他3組比較，溫和灸組自噬小體多于其他3組，且胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)如細(xì)胞核、細(xì)胞器等較為完整，提示溫和灸干預(yù)可增加神經(jīng)細(xì)胞自噬的表達(dá)水平。

圖4 各組大鼠脊髓及神經(jīng)根組織自噬小體及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的比較(10只鼠/組，標(biāo)尺=2μm)

4 討論

CSR的發(fā)病涉及頸項(xiàng)部“陽化氣”功能不足導(dǎo)致寒濕、瘀血等陰性病理產(chǎn)地堆積局部，阻滯經(jīng)絡(luò)，導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)痹阻不通而產(chǎn)生疼痛，故在治療上當(dāng)注重扶陽化氣以消陰翳?！渡窬慕?jīng)論》言：“夫灸取于人，以火性熱而至速……能消陰翳”，本研究選取大椎穴進(jìn)行溫和灸干預(yù)，可以起到溫補(bǔ)陽氣、散寒通路、化痰除濕、改善機(jī)體各項(xiàng)功能活動(dòng)的作用，是“陽化氣”理論的直接體現(xiàn)。臨床研究證實(shí)[17-18]，采用艾灸療法治療CSR能夠有效的緩解其頸痛癥狀，具有較好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一種膜性細(xì)胞器，是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、翻譯后修飾、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)以及鈣離子儲(chǔ)存與釋放的關(guān)鍵場所，在缺氧、炎性刺激、氧化應(yīng)激等有害因素的刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被打破，從而激活了ERS[19-20]。研究證實(shí)[21]，神經(jīng)病理性疼痛與ERS介導(dǎo)的細(xì)胞自噬與凋亡密切相關(guān)。ERS時(shí)，細(xì)胞自噬作為蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)的重要組分，是一種重要的代償保護(hù)機(jī)制，其通過促進(jìn)自噬體的形成回收、降解異常蛋白和細(xì)胞器以維持細(xì)胞代謝平衡，避免細(xì)胞的凋亡和壞死[22-23]；但如果ERS表達(dá)過強(qiáng)，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白大量堆積超過自噬代償機(jī)制時(shí)，將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6,24]，加重神經(jīng)病理性疼痛[21]。因此，適度上調(diào)細(xì)胞自噬，緩解細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激水平，減少細(xì)胞凋亡可能是緩解CSR神經(jīng)病理性疼痛的重要機(jī)制。

GRP78生理狀態(tài)下廣泛分布，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)迅速上調(diào)10-25倍，被認(rèn)為是ERS激活的重要標(biāo)志[25]；CHOP、Caspase-12是ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的兩條經(jīng)典通路，CHOP通過抑制抗凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄、增加促凋亡蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是ERS與凋亡的主要中間信號分子[26]；Caspase-12僅在ERS時(shí)被激活，經(jīng)過系列級聯(lián)反應(yīng)后激活凋亡執(zhí)行分子Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]，是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶[28]。本研究以GRP78反映CSR模型大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活水平，以CHOP、Caspase-12反映其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況，研究結(jié)果顯示，CSR模型大鼠脊髓及神經(jīng)根內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生過度表達(dá)，細(xì)胞自噬的代償保護(hù)機(jī)制被打破，細(xì)胞凋亡被激活，與此同時(shí)，大鼠痛閾值顯著下降。研究證實(shí)[29]，外源性增加細(xì)胞自噬可在一定程度上緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，減少細(xì)胞凋亡，而自噬小體的形成是細(xì)胞自噬過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，本研究通過透射電子顯微鏡下觀察自噬小體及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步探討溫和灸大椎穴治療CSR大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)機(jī)制及其與ERS介導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡的關(guān)系。

在本研究中，造模后大鼠痛閾值下降，經(jīng)溫和灸干預(yù)后大鼠痛閾值上升，說明溫和灸具有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，這與課題組前期研究相符[30]。王婷婷等[31]研究發(fā)現(xiàn)，艾灸可降低神經(jīng)根受壓迫模型大鼠炎性刺激誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷，提高大鼠痛閾；或可通過釋放活性物質(zhì)、鎮(zhèn)痛介質(zhì)、增加血流代謝、改善局部微循環(huán)、降低神經(jīng)傳導(dǎo)速度等途徑發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)[32,33]。本研究結(jié)果表明，溫和灸干預(yù)后，CSR大鼠自噬小體增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，ERS標(biāo)志性蛋白GRP78及其介導(dǎo)的凋亡因子CHOP、Caspase-12表達(dá)下降，大鼠痛閾值上升，提示溫和灸緩解CSR神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與ERS介導(dǎo)的細(xì)胞自噬與凋亡有關(guān)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬的增加可通過減少脊髓背角神經(jīng)元凋亡從而有效的緩解神經(jīng)病理性疼痛[34-36]。

3MA是一種特異性自噬抑制劑，通過抑制PI3K活性及自噬小體的形成，而抑制細(xì)胞的自噬過程[37]。本研究通過設(shè)置溫和灸+3MA組作為對照，發(fā)現(xiàn)與單純的溫和灸治療相比，應(yīng)用3MA后，神經(jīng)細(xì)胞的自噬小體減少，ERS應(yīng)激水平及凋亡因子表達(dá)升高，大鼠痛閾降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡與CSR神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)，上調(diào)細(xì)胞自噬水平可保護(hù)受損神經(jīng)。

綜上所述，溫和灸大椎穴能有效緩解CSR神經(jīng)病理性疼痛，具有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與激活細(xì)胞自噬，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。