羅敏怡，潘華山，鄭嘉怡，耿 雪，賀生才，荊純祥＊＊

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)體育健康學(xué)院 廣州 510006；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院 廣州 510520；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心 廣州 510405)

運動應(yīng)激性胃潰瘍是因劇烈運動引起的急性胃黏膜損傷，可表現(xiàn)為糜爛性胃炎，從無癥狀的淺表潰瘍病變、隱匿性胃腸出血到明顯的臨床消化道出血[1]，好發(fā)部位是胃體和胃底，其次見于胃竇及十二指腸，多發(fā)生于力竭性耐力運動項目的運動員，如馬拉松和游泳運動員。雖然輕微的運動應(yīng)激性胃黏膜損傷有自愈性，往往還未發(fā)現(xiàn)機體已恢復(fù)，但是急性的胃粘膜損傷會引起胃脘部疼痛，嚴(yán)重時可進展為消化道出血，危及生命，研究證實，應(yīng)激性潰瘍有1.5%到15%的可能性會繼發(fā)消化道出血，這取決于患者是否接受了應(yīng)激性潰瘍預(yù)防[2]。運動員為提高成績必須加大運動量，但是運動強度太大易引起應(yīng)激性損傷，預(yù)防運動應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)生對提高運動員身體素質(zhì)、訓(xùn)練質(zhì)量、競賽效率具有重要意義。應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)病機制尚無確切的結(jié)論，廣泛認(rèn)為這與中樞神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)、氧化應(yīng)激等相關(guān)，是在應(yīng)激狀態(tài)下，胃黏膜的保護因子無法跟損傷因子抗衡，而引發(fā)機體做出的非特異性防御反應(yīng)。隨著研究的深入，人們開始認(rèn)識到炎癥因子在應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生機制中也扮演了重要角色，但是相關(guān)研究尚少，具體的作用仍需要實驗論證。

目前臨床上防治應(yīng)激性潰瘍的措施主要有化學(xué)藥物抑制胃酸分泌(如奧美拉唑、雷尼替丁等)、抗酸藥物中和胃酸(如碳酸氫鈉、氫氧化鋁等)、細胞保護藥物抑制細胞凋亡等[3]，但僅能短時間改善癥狀，并且若長期服用存在腺體萎縮、肝功能受損、頭暈、乏力甚至是關(guān)節(jié)疼痛、心率失常、造血功能障礙、乳房發(fā)育異常、陽痿和全身性堿中毒等不良反應(yīng)[4,5]。如今，藥物安全越來越受重視，使用天然產(chǎn)物來開發(fā)副作用最小的藥物成為新趨勢。

中醫(yī)藥防治應(yīng)激性潰瘍的療效確切[6]，能有效地減少藥物的毒副作用。中醫(yī)認(rèn)為，應(yīng)激性胃潰瘍主要病因是內(nèi)因外因兩種，內(nèi)因多為情志所傷，外因為外邪侵襲，如風(fēng)寒、濕毒等困阻脾胃，郁而成瘀，導(dǎo)致氣血虧虛、肝郁氣滯，從而引起的胃脘痛、吞酸、嘈雜等脾胃疾病，治療上以理氣和胃或補氣活血為主[7]。半夏瀉心湯出自《傷寒論》，有和胃降逆、散結(jié)開痞之效，是治療痞證的代表方。在現(xiàn)代研究的基礎(chǔ)上，半夏瀉心湯適用范圍日漸擴大，多用于各種消化道疾病，如消化性潰瘍、結(jié)腸炎、幽門螺桿菌感染相關(guān)性胃炎等均取得很好療效[8]，并且可以減少機體的白介素-1(Interleukin-2，IL-2)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-8(Interleukin-8，IL-8)等炎癥因子的分泌，減輕消化道潰瘍癥狀，對防治應(yīng)激性胃潰瘍有一定的啟示意義。本實驗?zāi)康脑谟谔骄堪胂臑a心湯通過抑制炎癥反應(yīng)預(yù)防運動應(yīng)激性胃潰瘍的機制，為中醫(yī)藥防治運動應(yīng)激性胃潰瘍提供依據(jù)，探索防治運動應(yīng)激性胃潰瘍的新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

無特定病原體(Specific pathogen Free，SPF)級SD大鼠，雄性，體重200±20 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2018-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF動物實驗室，本實驗過程中對大鼠的處理已通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會同意。

1.1.2 儀器

JJ3000動物電子秤，G＆G公司產(chǎn)品；BS224S電子天平(1/萬)；圓柱形游泳水池(直徑64 cm，高73 cm)，常州恒尊塑料制品廠家；RESEE體育秒表，深圳市銳賽科技有限公司。德國SARTORIUS產(chǎn)品；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司產(chǎn)品；SCIENTZ-48型電動組織勻漿器，寧波新芝寧波新芝公司；3K30離心機，SIGMA公司產(chǎn)品；-80℃超低溫冰箱，美國Thermo公司產(chǎn)品；Bio-RAD 680酶標(biāo)儀，美國伯樂公司產(chǎn)品。CM1950自動真空組織脫水機、EG1160包埋機、RM2135石蠟切片機、HI 1210攤片機、HI 1220烘片機，Leica公司。

1.1.3 試劑

從版本角度來說，改革開放40年，我國圖書出版的創(chuàng)新發(fā)展成為主流。1978年圖書出版的版本，以再版圖書為主，一版一次的圖書有562種，占年度圖書出版的4.1%。2017年圖書出版的版本，以新版圖書為主，一版一次的圖書有295275種，占年度圖書出版的88.68%。為加強圖書出版的系統(tǒng)化管理，1991年，我國學(xué)習(xí)借鑒國際圖書出版管理的先進經(jīng)驗，引進了CIP圖書在版編目，使圖書出版版本管理的規(guī)范化、目錄著錄的標(biāo)準(zhǔn)化、服務(wù)公眾的信息化程度得到了進一步提升。

中藥飲片(法半夏、黃芩、黃連、干姜、甘草、人參)購自廣東省中醫(yī)院中藥房；奧美拉唑膠囊(批號：國藥準(zhǔn)字H20103295，生產(chǎn)批號：181102)，湖南方盛制藥有限公司。TNF-α試劑盒(批號：20180524)、IL-1β試劑盒(批號：20180524)、IL-6試劑盒(批號：20180524)均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 造模方法

取40只健康SPF級雄性成年大鼠，體重200g±20 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，記錄體重變化，并進行1次適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，將體重差異較大的及不會游泳的大鼠淘汰，留取32只大鼠，通過隨機數(shù)表法將其分為空白組(n=8)、模型組(n=8)、中藥組(n=8)、西藥組(n=8)，在完成最后1次灌胃后，通過一次性負重游泳力竭進行應(yīng)激性胃潰瘍造模。造模前禁食24 h，每只大鼠尾部系2%體重的金屬絲，以組為單位，依次將各組大鼠放入圓柱形游泳水池(直徑64 cm，高73 cm，水深50 cm)中游泳，力竭標(biāo)準(zhǔn)為“大鼠沉入水中，經(jīng)過10 s后仍不能返回水面”[9]。同時觀察大鼠，當(dāng)其運動極不協(xié)調(diào)、屢次下沉?xí)r，將其從水中撈出。造模完成后所有組別的大鼠取材。

1.2.2 干預(yù)方法

除空白組外均予藥物干預(yù)：中藥組予半夏瀉心湯0.01 mL·g-1灌胃，西藥組予0.01 mL·g-1奧美拉唑溶液灌胃，模型組予等量的蒸餾水灌胃，1天/次，連續(xù)7天。

1.2.3 取材

力竭游泳后，各組大鼠用10%水合氯醛(0.003 mL·g-1)腹腔注射麻醉，于劍突下腹正中線切開腹腔并游離胃，將胃取出，置于4%多聚甲醛固定l0min，沿胃大彎剪開胃腔并使胃黏膜展開，生理鹽水漂洗3遍后拍攝胃黏膜圖片，觀察其大體及計算潰瘍指數(shù)(Ulcer index，UI)。標(biāo)本留取分為2個部分：第1部分，在胃黏膜潰瘍或出血明顯處取0.5 cm×0.5 cm組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，進行蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色后，于鏡下觀察胃黏膜組織結(jié)構(gòu)；剩余的胃黏膜用冰冷生理鹽水反復(fù)沖洗3次后，用載玻片將胃黏膜刮下，放入冷凝管，并迅速放入液氮保存，留作酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)檢測胃黏膜細胞中腫瘤壞死因子-α(Tumour necrosis factor，TNF-α)、白介素-1β(Interleukin1，IL-1β)、白介素-6(Interleukin6，IL-6)的表達水平[10]。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 胃黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6的測定

1.3.2 計算UI

將全胃取下，沿胃大彎側(cè)將胃剪開，用生理鹽水沖洗胃黏膜，然后將胃展開平鋪在白紙上，相機拍攝胃黏膜圖像后于計算機下觀察潰瘍。按Guth標(biāo)準(zhǔn)[11]計算UI(點狀出血為1分；線狀出血，長度＜1 cm為2分，1-2=cm為3分，2-4 cm為4分，＞4 cm為5分，寬度＞1 cm時分值×2)

1.3.3 病理切片

在胃黏膜出血或糜爛明顯處取0.5 cm×0.5 cm組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，固定后用純水沖洗、修剪整齊后置于包埋盒中，放入自動脫水機進行脫水透明，脫水的步驟是：80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇2 h和二甲苯(2道透明)，石蠟包埋、切片，按脫蠟、復(fù)水、染色、脫水、透明、封片固定的順序完成HE染色后，通過顯微鏡觀察胃黏膜組織的結(jié)構(gòu)變化。

1.4 統(tǒng)計方法

運用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用one-way ANOVA，兩組間比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義，應(yīng)用GraphPad 5.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 胃黏膜TNF-α、IL-1β、IL-6的表達

空白組大鼠胃黏膜的IL-1β、IL-6、TNF-α的表達量均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。中藥組和西藥組的炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達量也明顯低于模型組的表達量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；中藥組的IL-1β、IL-6、TNF-α表達量與西藥組的相比無明顯差異(P＞0.05)(表1、圖1)。半夏瀉心湯和奧美拉唑均能有效抑制炎癥因子的表達，減輕炎癥反應(yīng)，保護胃黏膜。

圖1 胃黏膜IL-6、IL-1β、TNF-α的表達量

表1 胃黏膜IL-6、IL-1β、TNF-α的表達量

2.2 UI的差異

空白組大鼠胃黏膜的UI顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；中藥組和西藥組的UI均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，中藥組和西藥組對比UI無明顯差異(P＞0.05)(表2)。

2.3 胃黏膜解剖形態(tài)圖

肉眼可見，模型組大鼠的胃黏膜明顯充血紅腫，大量線狀、片狀出血點；西藥組和中藥組胃黏膜均有少許充血，有點狀出血；空白組胃黏膜紅潤光滑，無糜爛、無出血。

組別空白組模型組中藥組西藥組例數(shù)8 8 8 8潰瘍指數(shù)0images/BZ_374_1006_512_1026_531.png8.25±2.06 1.625±0.47*▲1.5±0.0.5*

圖2 胃粘膜解剖圖

2.4 病理切片

胃黏膜分為3層，分別是黏膜上皮層、固有層和黏膜肌層，急性應(yīng)激性胃潰瘍一般較淺，多損及黏膜上皮層和固有層，邊界清晰，偶爾破壞肌層，甚則穿孔。正常胃黏膜上皮為單層柱狀上皮，由表面黏液細胞組成，在HE染色下著色較淺以致透明。固有層約占2/3(與胃黏膜量度之比)主要由紅染的壁細胞和偏藍染的主細胞，這兩種細胞體積大、細胞質(zhì)豐富、核質(zhì)比小。壁細胞合成和分泌胃酸，主細胞分泌胃蛋白酶原，兩者對維持胃黏膜的穩(wěn)態(tài)起著重要作用[12]?？瞻捉M黏膜結(jié)構(gòu)完整無缺損，腺體排列整齊，未見明顯細胞或組織增生(圖3)。模型組大鼠胃粘膜上皮層脫落，邊界清晰；黏膜上皮層少許糜爛或斑駁脫落，腺體排列雜亂；上皮層和固有層大量紅細胞聚集，呈片狀出血灶，組織間隙充血水腫(圖4)。中藥組胃黏膜排列規(guī)則，黏膜少許增厚，組織間質(zhì)有條狀出血灶(圖5)。西藥組胃黏膜上皮結(jié)構(gòu)基本完整，腺體排列尚整齊，伴有組織的輕微水腫，組織間隙彌漫分布少量紅細胞，少許空泡樣變(圖6)。

圖3 空白組胃黏膜

圖4 模型組胃黏膜

圖5 中藥組胃黏膜

圖6 西藥組胃黏膜

3 討論

TNF-α、IL-1β，IL-6是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，它們能激活巨噬細胞，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子，并且促使炎性細胞游走和增強其功能，故又稱為促炎性細胞因子，是急性期反應(yīng)和炎癥反應(yīng)必不可少的催化因素，故可以用于判斷運動應(yīng)激性胃潰瘍的炎癥程度。

在無菌外科手術(shù)中，血清IL-6水平升高先于體溫升高和血清急性期蛋白濃度升高，所以IL-6常作為炎癥發(fā)生的敏感性指標(biāo)。在機體處于應(yīng)激狀態(tài)時，IL-6發(fā)出預(yù)警信號提示緊急事件的發(fā)生，啟動各項應(yīng)激機制，刺激核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)等一系列信號通路，增強炎性細胞因子如IL-6、TNF-α、IL-1β等mRNA的轉(zhuǎn)錄，同時，TNF-α和IL-1β也激活轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生IL-6[13]。過量的TNF-α可提高粘膜微小血管管壁通透性，破壞血管內(nèi)皮細胞，釋放炎癥介質(zhì)，刺激IL-1β的產(chǎn)生，導(dǎo)致中性粒細胞核聚集，提高其吞噬功能，最終產(chǎn)生粘膜血供障礙并加重粘膜炎癥反應(yīng)[14]。IL-1β蛋白是一種可誘導(dǎo)的蛋白，在微生物入侵或組織損傷時合成，是局部炎癥和保護反應(yīng)發(fā)生的必要條件。研究表明，消化性潰瘍患者和幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori，Hp)陽性患者[15]、灌胃給予乙醇[16]和應(yīng)激誘導(dǎo)后，血清中IL-1β的生成增加；細胞因子也直接增加垂體前葉[17]細胞分泌促腎上腺皮質(zhì)激素和腦內(nèi)啡肽。這證實了細胞因子作為體液因子的作用，增強了應(yīng)激后反應(yīng)的嚴(yán)重程度。

與此同時，神經(jīng)內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)環(huán)路與細胞因子表達呈相關(guān)性，這些促炎癥細胞因子會強烈刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸(The hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)釋放糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)。而GC能夠誘導(dǎo)抗炎因子的合成以及抑制炎癥因子的合成，并穩(wěn)定溶酶體膜，保護胃粘膜細胞免受炎癥因子的損害，從而形成一個神經(jīng)內(nèi)分泌的完好循環(huán)[18]。運動應(yīng)激性胃潰瘍大鼠胃粘膜中IL-6、IL-1β和TNF-α等細胞因子顯著增加時，打破了這個穩(wěn)態(tài)循環(huán)，間接地誘發(fā)了潰瘍的形成。

現(xiàn)代研究證實，半夏瀉心湯具有消炎、抑菌和雙向調(diào)節(jié)胃腸運動的功能，促進相關(guān)激素、蛋白分泌，有助于胃腸組織的局部生長，可以提高機體免疫力，故而此方在臨床的使用范圍越來越廣，尤其是消化系統(tǒng)疾病。多項實驗研究證實半夏瀉心湯有保護胃黏膜的作用，徐穎等[19]提出半夏瀉心湯可調(diào)控血液、胃和腦組織的血管活性肽的產(chǎn)生和釋放，維持胃黏膜的完整性。張忠等[20]表明半夏瀉心湯全方和各拆方組，可通過控制腦及胃內(nèi)自主神經(jīng)分泌，保護胃黏膜，減少潰瘍；姜惟等[21]的動物實驗提示半夏瀉心湯可提高超氧化歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活力，阻止或降低組織的脂質(zhì)過氧化酶反應(yīng)，從而降低自由基對胃黏膜的刺激，保護胃黏膜。周文等人[22]認(rèn)為半夏瀉心湯通過下調(diào)Hp感染小鼠機體血清TNF-α含量，減輕了胃黏膜的炎癥反應(yīng)從而保護胃黏膜。實驗證明，半夏瀉心湯有明顯的抗炎作用，抑制細胞因子的表達，它可能通過調(diào)節(jié)巨噬細胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)炎癥信號通路中細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)、P38的磷酸化水平，抑制巨噬細胞分泌炎癥因子IL-1β、IL-8和TNF-α[23]。

本實驗也通過半夏瀉心湯干預(yù)觀察其對運動應(yīng)激性胃潰瘍大鼠的胃黏膜保護作用，大鼠在力竭運動的應(yīng)激狀態(tài)下，炎癥反應(yīng)被激活，炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α大量表達，在本次實驗中，模型組的TNFα、IL-1β、IL-6與空白組的相比表達量明顯增加，而半夏瀉心湯組和西藥組大鼠的表達明顯降低；說明半夏瀉心湯能有效地抑制大鼠胃黏膜的炎癥因子的表達。同時，半夏瀉心湯組和西藥組的潰瘍指數(shù)明顯比模型的的潰瘍指數(shù)減少，病理切片跟模型組相比，通過造模前給予半夏瀉心湯或奧美拉唑灌胃，胃粘膜病理學(xué)形態(tài)改善明顯，說明半夏瀉心湯可抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而保護胃黏膜，減少應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生。但是，因為半夏瀉心湯的藥物組成較為復(fù)雜，有效成分有百余種，包括槲皮素、黃芩苷、甘草苷等都已在臨床和實驗中驗證有抗炎作用，具體的發(fā)揮消炎抑菌、保護胃黏膜的的成分未明[24]，是復(fù)合藥物共同產(chǎn)生的療效還是其中某一藥物單體的作用尚需商榷，這將會是以后的研究方向，為防治運動應(yīng)激性潰瘍尋找更精準(zhǔn)有效的中醫(yī)藥療法。

4 結(jié)論

半夏瀉心湯可提高機體免疫力，降低胃黏膜中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達，抑制炎癥反應(yīng)，減少運動應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)生。也啟示我們以后研究方向可以進行中藥復(fù)方與藥物單體的療效對比，尋找更精準(zhǔn)有效、無毒的中醫(yī)藥療法預(yù)防運動應(yīng)激性胃潰瘍。