唐維我，張會(huì)永，李 芹，李 佳，楊關(guān)林

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 沈陽(yáng) 110032)

腎陽(yáng)虛證是中醫(yī)常見(jiàn)證候之一，又稱作元陽(yáng)虧虛證、命門火衰證，是由于腎陽(yáng)虧虛、機(jī)體失于溫煦所致，臨床以畏寒肢冷，腰膝以下尤甚，面色晄白或黧黑，小便清長(zhǎng)，夜尿多，舌淡苔白，脈弱等為主要表現(xiàn)[1]。目前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)比《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》中的臨床腎陽(yáng)虛癥狀作為造模成功與否的標(biāo)志[2]。腎陽(yáng)虛證臨床表現(xiàn)中的畏寒、小便清長(zhǎng)、夜尿多，在動(dòng)物行為中表現(xiàn)為蜷縮喜堆，小便清長(zhǎng)、量多；肢冷可通過(guò)測(cè)量體表溫度得知；喜溫、倦怠可通過(guò)觀察動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)獲得，表現(xiàn)為蜷縮聚堆、精神不振、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少、肢體力量下降等；舌脈可在動(dòng)物體直接觀察。腎陽(yáng)虛證在呼吸、循環(huán)、內(nèi)分泌、消化等系統(tǒng)的疾病中均有表現(xiàn)，為了更好的治療腎陽(yáng)虛所引起的疾病，學(xué)術(shù)界一直致力于腎陽(yáng)虛證本質(zhì)的研究，并探索出多種復(fù)制腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型的方法。但由于動(dòng)物種類、造模方法繁多，用藥種類、給藥方式均不相同，造模時(shí)間也長(zhǎng)短不一，且造模后動(dòng)物出現(xiàn)的宏觀表征各不相同，并且評(píng)價(jià)模型所用的微觀指標(biāo)也各有差異，暫無(wú)模型成功的系統(tǒng)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，因此如何選取適合的動(dòng)物模型以及造模方式為臨床治療此類病癥具有重大意義。本文于CNKI、維普、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“腎陽(yáng)虛證”“腎陽(yáng)虛模型”“溫腎助陽(yáng)”等為檢索詞，查閱自1959年至2020年4月有關(guān)腎陽(yáng)虛及腎陽(yáng)虛相關(guān)疾病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)共567篇，總結(jié)其造模方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)其進(jìn)行分析與探討。

1 模型動(dòng)物

在腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型的選取中以大鼠小鼠為主，也有少部分實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了家兔[3]、豚鼠[4]與小型豬[5]，但大型的哺乳動(dòng)物，例如猴、狗等應(yīng)用較少。雖然小型哺乳動(dòng)物有易操作、成本低的優(yōu)點(diǎn)，但大型哺乳動(dòng)物的生理生化指標(biāo)與人類更加接近[6]，因此現(xiàn)在的造模方式依然存在著一些局限。

2 造模方法

2.1 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病理造模

2.1.1 藥物造模

應(yīng)用藥物造模的方法中多使用糖皮質(zhì)激素、抗甲狀腺藥、性激素、羥基脲、腺嘌呤。1963年鄺安堃等[7]首次通過(guò)氫化可的松肌注的方法，使小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量降低、尿量增加、蜷縮萎頓、毛發(fā)萎黃無(wú)光澤等類似腎陽(yáng)虛的癥狀；1984年，夏宗勤等[15]首次使用他巴唑在小鼠上建立了腎陽(yáng)虛模型，發(fā)現(xiàn)小鼠的cAMP/cGMP比值下降，耗氧率明顯降低，但未對(duì)小鼠的行為學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)；隨后還有學(xué)者利用雌二醇或睪酮在動(dòng)物體復(fù)制腎陽(yáng)虛模型[16]，出現(xiàn)了皮毛無(wú)光澤、豎毛，背腹部潮濕出汗，蜷縮，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，體重降低等表現(xiàn)。此3種方法都是通過(guò)模擬下丘腦-垂體-靶腺軸受抑制的病理狀態(tài)，使動(dòng)物表現(xiàn)出“腎陽(yáng)虛”的表現(xiàn)。

此外，常用的方法還有羥基脲灌胃[17]，這是因?yàn)榱u基脲可抑制核苷酸的代謝與DNA的合成，使蛋白質(zhì)代謝發(fā)生相應(yīng)的改變，導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)毛發(fā)枯槁疏松、脫落，攝食及活動(dòng)明顯減少，精神萎靡，蜷縮、消瘦，呼吸急促等虛損癥狀，甚至死亡。南亞昀等[18]給予大鼠150 mg·kg-1腺嘌呤混懸液灌胃，30天后大鼠出現(xiàn)體重下降、弓背蜷縮、反應(yīng)遲鈍、體毛稀疏、畏寒、并失去光澤等表現(xiàn)。這是因?yàn)橄汆堰实拇x產(chǎn)物會(huì)引起腎衰，其產(chǎn)物毒性還會(huì)影響腎組織的能量代謝，進(jìn)而出現(xiàn)一系列的陽(yáng)虛表現(xiàn)?，F(xiàn)將各種藥物造模的機(jī)制、具體應(yīng)用方法、模型表現(xiàn)及特點(diǎn)與不足整理(表1)。

表1 藥物造模的方法、機(jī)制、模型表現(xiàn)及特點(diǎn)與不足

2.1.2 手術(shù)造模

手術(shù)造模的機(jī)制均為切除器官以抑制相應(yīng)的下丘腦-垂體-靶腺軸，使動(dòng)物體表現(xiàn)出腎陽(yáng)虛的癥狀。

例如，呂銀娟等[19]切除了大鼠雙側(cè)3/4腎上腺，4周后出現(xiàn)精神不振、活動(dòng)減少、體毛稀疏、干枯無(wú)光澤等表現(xiàn)，且體溫和尿17-羥皮質(zhì)類固醇(尿17-OHCS)含量均顯著降低；盧德趙等[20]通過(guò)切除雙側(cè)甲狀腺，使大鼠表現(xiàn)出腎陽(yáng)虛的癥狀，且有甲狀腺激素水平的下降；吳月國(guó)等[21]切除了大鼠的雙側(cè)睪丸，大鼠出現(xiàn)活動(dòng)量減少，體重明顯減輕等表現(xiàn)，并伴有性激素的水平下降。將手術(shù)造模的機(jī)制、具體應(yīng)用方法、模型表現(xiàn)及特點(diǎn)與不足整理(表2)。

表2 手術(shù)造模的方法、機(jī)制、模型表現(xiàn)及特點(diǎn)與不足

2.1.3 多因素造模

除單因素造模的方法外，還有學(xué)者利用多因素聯(lián)合的方法建造腎陽(yáng)虛模型。例如王郭琦等[22]利用1%腺嘌呤+1%地塞米松飼料喂養(yǎng)的方法建造模型，30天后出現(xiàn)了怕冷畏寒喜暖，生殖減退，體溫降低，小便清長(zhǎng)，蜷縮弓背，精神萎靡；血清睪酮(T)含量升高，游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)、總?cè)饧谞钕僭彼?TT3)、總四碘甲狀腺原氨酸(TT4)明顯降低，尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)升高的特點(diǎn)；楊鑒冰等[23]利用地塞米松肌注+雙側(cè)卵巢切除的方法，誘導(dǎo)腎陽(yáng)虛子宮發(fā)育不良模型；董興剛等[24]通過(guò)切除單側(cè)腎并注射阿霉素2次的方法建造腎陽(yáng)虛的模型，但并未提及模型的表現(xiàn)。

2.2 中醫(yī)病因造模

2.2.1 房勞模型

房勞過(guò)度，又稱“腎勞”。是指房事太過(guò)耗傷腎精、腎氣而致病。由于腎藏精，為封藏之本，腎精不宜過(guò)度耗泄。據(jù)此，有學(xué)者制備出“勞倦過(guò)度、房勞不節(jié)”腎陽(yáng)虛雄性小鼠模型。李震等使小鼠頻繁交配并強(qiáng)迫小鼠游泳，模擬房事不節(jié)、勞倦過(guò)度，誘發(fā)腎陽(yáng)虛[25]。小鼠出現(xiàn)萎靡不振、畏寒怕冷、拱背少動(dòng)等表現(xiàn)，其睪丸、胸腺重量、睪丸組織乳酸脫氫酶(LDH)總活性及乳酸脫氫同工酶X(LDH-X)相對(duì)活性都明顯降低。

2.1.2 老年大鼠模型

也有學(xué)者選擇年老的大鼠等作為腎陽(yáng)虛模型?！秾?shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型》中提出，若將人類的60歲作為老年的標(biāo)準(zhǔn)，老年大鼠應(yīng)為1.7歲，小鼠為1.3歲，狗為10歲，豚鼠則為4.8歲。例如丁克祥等人利用2-3月齡的小鼠模擬年老模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[26]。

2.1.3 恐傷腎模型

在中醫(yī)理論中，肝在志為怒，心在志為喜，脾在志為思，肺在志為憂，腎在志為恐。根據(jù)七情內(nèi)傷的理論，沈雁等用貓嚇鼠、人嚇貓、爆竹嚇狗的方法進(jìn)行造模[27]。

3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

3.1 宏觀表征

腎陽(yáng)虛證臨床以畏寒肢冷，腰膝以下尤甚，面色晄白或黧黑，小便清長(zhǎng)，夜尿多，舌淡苔白，脈弱等為主要表現(xiàn)。文獻(xiàn)中當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)爪甲與耳廓顏色變淡、體毛枯疏并失去光澤、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、弓背蜷縮、喜扎堆等畏寒怕冷表現(xiàn)，食量及飲水量減少，體溫及體質(zhì)量顯著下降等表現(xiàn)時(shí)[19,28-30]，即評(píng)價(jià)造模成功。

3.2 微觀指標(biāo)

腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型中常有以下指標(biāo)的改變，如：環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量下降，環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)含量升高，cAMP/cGMP比值降低[28,31]；血清三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)水平明顯下降，促甲狀腺激素釋放激素(TSH)含量減少[32,33]；雄鼠血清T含量減少、雌鼠血清雌二醇(E2)含量減少，精子計(jì)數(shù)明顯減少，活動(dòng)精子百分率顯著降低，且畸形精子百分率明顯升高[34]；尿17-OH-CS含量減少[19]；睪丸、附睪、胸腺、脾等臟器指數(shù)降低，腎臟、睪丸等組織也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的病理改變，例如腎小球及間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小球壞死、睪丸中生精細(xì)胞變性或壞死脫落等[35]。現(xiàn)將腎陽(yáng)虛模型動(dòng)物常見(jiàn)的微觀指標(biāo)整理(表3)。這些微觀指標(biāo)的變化雖表現(xiàn)在不同動(dòng)物中，但仍不能全面概括腎陽(yáng)虛本質(zhì)的表現(xiàn)。

表3 腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型微觀指標(biāo)的評(píng)價(jià)

3.3 反證方劑

方劑反證是驗(yàn)證模型成功與否的必要條件，用來(lái)反證腎陽(yáng)虛模型主要有藥物和方劑2種。藥物主要包括白附子[36]、菟絲子[37]、淫羊藿[38]、覆盆子[39]、山茱萸[40]等；反證方劑主要有加味五子衍宗丸[41]、金匱腎氣丸[28]、右歸丸[25]、七寶美髯丹[43]、二仙湯[38]等；反證的方式還包括針刺[44]與艾灸[45]。這些藥物與方劑均有溫腎助陽(yáng)的作用，因此可以改善模型動(dòng)物的腎陽(yáng)虛癥狀，以及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，進(jìn)而判定模型建造成功。

4 討論

4.1 造模方法

現(xiàn)今學(xué)術(shù)界常用的腎陽(yáng)虛造模方法可分為病因造模與病理造模兩方面，病理造模主要分為藥物造模、手術(shù)造模與多因素聯(lián)合造模；病因造模主要為根據(jù)中醫(yī)病因模擬腎陽(yáng)虛，包括房勞模型、恐傷腎模型、老年動(dòng)物模型。

藥物造模中包括糖皮質(zhì)激素、抗甲狀腺藥物、性激素、腺嘌呤、羥基脲等，其中糖皮質(zhì)激素、抗甲狀腺藥物、性激素3種藥物的作用機(jī)制為模擬下丘腦-垂體-靶腺軸(腎上腺、甲狀腺、性腺)受抑制時(shí)的病理狀態(tài)，從而使動(dòng)物產(chǎn)生類似“腎陽(yáng)虛”的虛損癥狀。其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單且易于控制，成本低，成模時(shí)間短，多為1周至3周。而且應(yīng)用此類藥物時(shí)能良好的相應(yīng)靶腺軸受抑制的疾病狀態(tài)，特異性強(qiáng)。例如當(dāng)研究與生殖相關(guān)疾病時(shí)，蘇潔等[46]通過(guò)雌二醇腹腔注射的方法，使大鼠表現(xiàn)出明顯的生殖機(jī)能下降。張文釗等[47]以25 mg·kg-1的劑量給予大鼠肌肉注射，15天后大鼠出現(xiàn)肛溫降低、大便溏薄等“寒象”以及腎上腺、下丘腦、垂體臟器指數(shù)的降低；但其不足也在于只能反映單一靶腺軸受抑制的病變，例如，歐陽(yáng)軼強(qiáng)等[48]在應(yīng)用他巴唑這種抗甲狀腺藥物造模的時(shí)候，大鼠出現(xiàn)了明顯的體溫下降和血清中T3、T4的下降，但腎上腺軸、性腺軸的改變不明顯。且在使用糖皮質(zhì)激素肌注造模時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)注射部位的潰爛[49]，動(dòng)物體的損傷也會(huì)對(duì)動(dòng)物的狀態(tài)以及機(jī)能造成影響。并且，氫化可的松也是建造腎陰虛模型的常用藥物[50]，在兩種模型造模方法中的不同通常在于腎陰虛的給藥時(shí)間更長(zhǎng)，但兩種模型的給藥時(shí)間沒(méi)有明確的界限。因此雖然糖皮質(zhì)激素肌注造模是現(xiàn)今最常用的模型，但仍然有許多需要解決的問(wèn)題。腺嘌呤灌胃造模也是經(jīng)常使用的造模方法，但其存在著藥物劑量大、造模時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，而且腺嘌呤在體內(nèi)黃嘌呤氧化酶的作用下轉(zhuǎn)變成極難溶解于水的2,8-二羥基腺嘌呤，該產(chǎn)物會(huì)沉積于腎小管引起腎衰，造成動(dòng)物的死亡。

手術(shù)造模也是通過(guò)抑制靶腺軸來(lái)模擬腎陽(yáng)虛的癥狀，雖然其操作簡(jiǎn)單，但對(duì)動(dòng)物體傷害較大，且不可逆，容易造成動(dòng)物的死亡。復(fù)合因素造模的動(dòng)物模型雖然可以從多個(gè)方向復(fù)制模型，使其反應(yīng)的“腎陽(yáng)虛”癥狀更加全面，但操作略復(fù)雜。

中醫(yī)的病因造?？梢院芎玫膹?fù)制因腎陽(yáng)虛引起的“虛寒”癥狀，與西醫(yī)的病理造模相比更符合中醫(yī)病因，且兼夾證候少。但病因造模也存在著一定的問(wèn)題，例如驚恐傷腎和房勞傷腎的模型所需的動(dòng)物數(shù)量太多，房勞的模型需要多只雌鼠配合，恐傷腎中的貓嚇鼠模型，每天需要老鼠喂貓，增加了動(dòng)物模型的消耗，成本過(guò)高。對(duì)于老年大鼠而言，年老的動(dòng)物模型至今仍無(wú)統(tǒng)一的年老標(biāo)準(zhǔn)，受客觀因素的影響也較大。生物體發(fā)展到老年的時(shí)候也伴隨著各個(gè)系統(tǒng)的老化，并不單純是腎陽(yáng)虛，在中醫(yī)理論中，衰老更多屬于腎精的虧虛，因此將老年動(dòng)物等同于腎陽(yáng)虛并不標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

就評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)而言，現(xiàn)有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大多通過(guò)行為學(xué)特征、生化標(biāo)準(zhǔn)和反證方劑來(lái)判斷所造成的模型是否成功。3方面應(yīng)互相結(jié)合來(lái)判斷模型是否成功，但大多文獻(xiàn)中只對(duì)動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)做出了描述，當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)毛發(fā)豎起且無(wú)光澤，精神萎靡，飲食量下降，體質(zhì)量明顯降低等癥狀時(shí)即表明造模成功，未進(jìn)一步結(jié)合理化指標(biāo)。這樣存在的問(wèn)題在于，單從外在來(lái)看，精神萎靡、飲食量下降、畏寒等癥狀并不是腎陽(yáng)虛所獨(dú)有，比如脾陽(yáng)虛證和腎陽(yáng)虛證的癥狀表現(xiàn)就存在較大交叉性[51]，因此評(píng)價(jià)模型成功的標(biāo)準(zhǔn)并不嚴(yán)謹(jǐn)。而且癥狀和體征依賴于主觀評(píng)價(jià)，難免造成主觀上的偏倚。且很少有實(shí)驗(yàn)研究能夠結(jié)合中醫(yī)特色的舌脈觀察，對(duì)于小鼠此類小型動(dòng)物來(lái)說(shuō)觀察舌脈也具有一定困難，如何將中醫(yī)更好的結(jié)合到診斷中也是值得思考的問(wèn)題。

對(duì)于微觀指標(biāo)來(lái)說(shuō)，現(xiàn)今評(píng)判“腎陽(yáng)虛”的指標(biāo)均過(guò)于普遍。例如，與腎臟功能相關(guān)的研究選取皮質(zhì)醇(CORT)、肌酐(Cr)；與生殖機(jī)能相關(guān)則選取睪酮(T)、雌二醇(E2)；此外還有與甲狀腺機(jī)能減退相關(guān)的甲狀腺激素等，此類指標(biāo)并未有與腎陽(yáng)虛的密切關(guān)聯(lián)。除此之外，還有很多實(shí)驗(yàn)將腎臟或生殖器官的病理變化作為腎陽(yáng)虛的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，但生物體作為一個(gè)整體，疾病的發(fā)生都會(huì)造成某些器官的病理變化。因此，這些指標(biāo)的選取在某種程度上與腎陽(yáng)虛并不具有特異性。而且更多的文獻(xiàn)中并沒(méi)有對(duì)建立的動(dòng)物模型行為學(xué)表現(xiàn)的描述，或微觀指標(biāo)改變的敘述，甚至沒(méi)有對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)[52,53]。因此，指標(biāo)的選取應(yīng)該更加貼近于臨床，選取在臨床試驗(yàn)中具有代表性的腎陽(yáng)虛指標(biāo)在動(dòng)物體上進(jìn)行評(píng)價(jià)。

筆者在總結(jié)文獻(xiàn)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，利用反證方劑來(lái)評(píng)價(jià)模型也是常用的方法，但也存在著一些問(wèn)題。例如李耿[54]在驗(yàn)證通過(guò)氫化可的松建立的腎陽(yáng)虛模型時(shí)應(yīng)用了六味地黃丸和知柏地黃丸，但這兩個(gè)方劑是用來(lái)治療腎陰虛的常用方。且應(yīng)用后小鼠“腎陽(yáng)虛”的癥狀有所好轉(zhuǎn)，這是否說(shuō)明利用氫化可的松建造的“腎陽(yáng)虛”模型不一定真的能夠反應(yīng)腎陽(yáng)虛的本質(zhì)？因此造模方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)還需要進(jìn)一步明確。

4.3 模型動(dòng)物

用于腎陽(yáng)虛造模的動(dòng)物種類繁多，雖然大鼠小鼠因其體型小、易飼養(yǎng)、易操作的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，但模型的選擇也與所研究的疾病有一定的關(guān)聯(lián)。例如，當(dāng)研究腎陽(yáng)虛所致的水腫或者多尿疾病時(shí)經(jīng)常使用大鼠模型[55,56]；變應(yīng)性鼻炎的腎陽(yáng)虛證經(jīng)常使用豚鼠作為研究動(dòng)物[57]；此外，衰老模型[58,59]也經(jīng)常被使用。小型的哺乳動(dòng)物雖然存在優(yōu)勢(shì)，但仍存在問(wèn)題，比如中醫(yī)體系中特有的舌象、脈象信息很難收集，但這些資料在大型的哺乳動(dòng)物上采集就較為容易，而且大型的哺乳動(dòng)物與人類更為接近，因此可以嘗試在小型豬等大型的哺乳動(dòng)物上進(jìn)行腎陽(yáng)虛相關(guān)的研究。

5 總結(jié)

綜上所述，雖然目前的腎陽(yáng)虛造模方法各異，但均存在著一些問(wèn)題。病理造模簡(jiǎn)單易行，但未能反應(yīng)腎陽(yáng)虛的中醫(yī)病因。病因造模雖能反映本質(zhì)，但不易操作，且所需時(shí)間較長(zhǎng)。對(duì)于模型的評(píng)價(jià)也大多只體現(xiàn)了動(dòng)物的宏觀表征，以微觀指標(biāo)佐證模型建造成功的實(shí)驗(yàn)較少，且也未能從微觀層面揭示腎陽(yáng)虛的本質(zhì)。

因此，若能將中醫(yī)病因做為前提，與病理造模結(jié)合在一起，吸取雙方的優(yōu)勢(shì)，可以建造出短時(shí)高效又符合中醫(yī)病因的模型；同時(shí)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該將宏觀表征與能夠良好的反應(yīng)腎陽(yáng)虛“耗竭”狀態(tài)的微觀指標(biāo)相結(jié)合，建造出更加完善的模型建造體系。