郭一博 石鏡明 劉 航 李巖松 孫正啟

（西藏民族大學醫(yī)學部神經(jīng)疾病阿爾茨海默癥的發(fā)病機制及藏藥干預研究團隊，咸陽 712082）

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一種典型的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是β淀粉樣蛋白（amyloid beta peptide，Aβ）在神經(jīng)元胞外聚集形成淀粉樣斑，tau蛋白在胞內(nèi)過度磷酸化產(chǎn)生神經(jīng)纖維化纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）[1]。AD主要包括兩種類型：家族遺傳性阿爾茨海默癥（familial Alzheimer's disease，F(xiàn)AD） 和散發(fā)性阿爾茨海默癥（sporadic Alzheimer's disease，SAD）。FAD主要由早老素1（presenilin，PS1）、PS2和APP基因變異所致，SAD原因多樣，尚不能確定病因[2]。目前AD發(fā)病機制尚未明確，也未找到準確的早期診斷標準以及有效的治療方法，但以β淀粉樣蛋白異常聚集導致神經(jīng)細胞功能受損的淀粉樣級聯(lián)假說占據(jù)主導地位[3]。

研究表明，在AD癥狀出現(xiàn)的前15～20年，Aβ已經(jīng)在患者腦內(nèi)聚集并伴隨著認知能力的下降[4]。從去世患者腦內(nèi)的老年斑中可以提取大量的Aβ蛋白，這種蛋白來源于β淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）。APP是一種I型跨膜單鏈糖蛋白，在腦組織中有2條經(jīng)典代謝途徑。APP在人體中廣泛存在，在促進神經(jīng)細胞增殖分化、促進突觸形成、生長和牽引等方面發(fā)揮重要作用[5]。

正常情況下，APP僅產(chǎn)生具有營養(yǎng)細胞作用的可溶性片段，但當APP基因發(fā)生突變時，β分泌酶和γ分泌酶裂解APP可能性增加，并釋放出以Aβ40和Aβ42為主要形式的Aβ肽段，這些肽段能自發(fā)聚集形成各種聚集體，其中，Aβ42較Aβ40更容易聚集，這些可溶性的聚集體在腦內(nèi)被小膠質(zhì)細胞吞噬，并釋入炎癥因子損傷腦神經(jīng)元，產(chǎn)生慢性神經(jīng)退行性病變，最終導致AD的發(fā)生[6]?，F(xiàn)有的AD藥物不能有效地調(diào)節(jié)發(fā)病機制或延緩疾病的進展，盡管如此，人們并沒有放棄此類藥物的研發(fā)，例如：代謝APP和Aβ肽的分泌酶，因其具有良好的治療潛力而備受關(guān)注；在復雜疾病的多藥治療中，開始考慮多靶點分泌酶調(diào)節(jié)劑；分泌酶相關(guān)的靶向藥物的發(fā)現(xiàn)也充滿挑戰(zhàn)性等[7]?，F(xiàn)分析近年來關(guān)于APP代謝及其代謝產(chǎn)物Aβ作為藥物靶點治療AD的研究，研究結(jié)果將為該領(lǐng)域內(nèi)尋求Aβ相關(guān)藥物提供一定的參考。

1 APP結(jié)構(gòu)

APP是I型跨膜蛋白，含有19個外顯子，分子量110～130 kD，有365～770個氨基酸，其編碼基因位于人21號染色體長臂中段[8]。它類似于一種細胞表面受體，由一個較大的N端胞外區(qū)、跨膜區(qū)和一個較小的C端胞內(nèi)區(qū)組成。APP分子從N端到C端，總體上可以劃分為3個高度保守的區(qū)域：E1區(qū)域、E2區(qū)域和C端區(qū)域（圖1）[9]。人體APP主要有3種亞型：APP695、APP751和APP770。其中APP695和APP751可以稱為類淀粉樣前體蛋白質(zhì) （amyloid precursorlike proteins，APLPs），又可以分別稱為類淀粉樣前體蛋白1（APLP1）和APLP2[8]。不同亞型的APP在體內(nèi)分布不同。APP770包含全部外顯子，在不同的組織細胞中都有表達；APP751僅缺少第8號外顯子，在T淋巴細胞中含量豐富；而APP695缺少第7號和第8號外顯子，主要存在于神經(jīng)組織中[9]。當神經(jīng)元分化時，APP695呈爆發(fā)式表達，而在腦損傷后，含Kunitz 型蛋白酶抑制劑（Kunitz-type protease inhibitor，KPI）結(jié)構(gòu)域的APP751和APP770含量在小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞中充分增加[10]。雖然APP、APLP1、APLP2在氨基端和羧基端的序列結(jié)構(gòu)很相似，但Aβ序列只存在于APP中，而不存在于APLPs中。因此，相似的結(jié)構(gòu)使APLPs成為研究APP時最常用的對照蛋白[9-10]。

圖1 淀粉樣前體蛋白（APP）主要3 種亞型[10]

APP的1～8號氨基酸是信號肽（signal peptide，SP）序列，可以在編碼APP的基因翻譯后，將APP蛋白導入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，APP進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后會產(chǎn)生蛋白折疊、磷酸化和糖基化等，同時也是其進入細胞膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的關(guān)鍵步驟。缺失SP后，盡管APP可以在細胞內(nèi)表達，但是其向細胞外的分泌會受到影響[11]。

E1區(qū)域（氨基酸序列：28～190）包括一個肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（heparin-binding domain，HBD1），又名類生長因子結(jié)構(gòu)域（growth factor-like domain，GFLD）和一個銅結(jié)合結(jié)構(gòu)域（copper-binding domain，CuBD）[9]。HBD1結(jié)構(gòu)域包括反向平行β折疊片、α螺旋和2條短的β折疊片，并由3對二硫鍵交錯連接[10]。CuBD結(jié)構(gòu)域是由3條反平行β折疊片、α螺旋和另外3對二硫鍵連接組成。這2個結(jié)構(gòu)域之間由連接序列（Gly120-Leu132）連接，它雖然沒有二級結(jié)構(gòu)，卻能像繩子一樣連接著這2個結(jié)構(gòu)域[12]。

E1和E2區(qū)域之間是一個高度酸性的區(qū)域（acidic domain，AcD），在體外很容易被降解，其中大部分氨基酸為Asp和Glu，使它難以形成有序折疊的結(jié)構(gòu)，只能在E1和E2之間起連接作用[13]。在APP751中，酸性區(qū)域與E2區(qū)域之間存在一個KPI結(jié)構(gòu)域；在APP770中，酸性區(qū)域與E2區(qū)域之間存在KPI和Ox-2抗原結(jié)構(gòu)域[10]。KPI結(jié)構(gòu)域是56個氨基酸組成的Kunitz型蛋白酶抑制劑。它由單一第7號外顯子編碼，而且僅存在于非神經(jīng)元的APP種類中。KPI結(jié)構(gòu)域可以折疊成獨立單元，擁有KPI結(jié)構(gòu)域的APP是低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP）的配體，它可以與其相互作用而被內(nèi)吞。在APP770中，KPI結(jié)構(gòu)域鄰近的一小段是Ox-2抗原結(jié)構(gòu)域，由19個氨基酸組成，它與其他蛋白質(zhì)沒有顯著的同源性[13]。

E2區(qū)域又稱為APP中心結(jié)構(gòu)域（central APP domain，CAPPD），是能夠獨立折疊的區(qū)域，由6個α螺旋形成2個超螺旋結(jié)構(gòu)，是一個相對簡單的蛋白質(zhì)超二級結(jié)構(gòu)[13]。包含一個促胸腺生成素序列（RERMS）和一個高親和力的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（HBD2）[10，13]。E2結(jié)構(gòu)域中的RERMS具有生長因子的作用。與HBD1相比，HBD2具有更長的形狀，似乎更有利于緊密結(jié)合肝素[13]。

C端區(qū)域包括跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TMD）和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（APP intracellular domain，AICD）[10]。TMD螺旋高度彎曲，彎曲頂點近Gly708-709，約在脂質(zhì)體中心位置處，Gly708賦予TMD高度柔韌性，使其能很好適應γ分泌酶加工方式。AICD是APP被γ分泌酶切割釋放的胞內(nèi)片段，共49～50個氨基酸。AICD釋放到胞質(zhì)中可能發(fā)揮細胞核信號轉(zhuǎn)導功能[13]。

2 APP代謝過程

APP的代謝由α分泌酶、β分泌酶和γ分泌酶這3種水解酶介導。α分泌酶或β分泌酶在胞外結(jié)構(gòu)域?qū)PP進行切割，釋放出APP外結(jié)構(gòu)域分泌的片段，這些片段可以被共同稱為APPs（也稱為sAPP片段），也可以分別稱為sAPPα（soluble APP alpha protein）和sAPPβ（soluble APP beta protein）。這2個片段至少占大腦中APP的50%。β和γ分泌酶依次切割APP，并釋放出具有神經(jīng)毒性的Aβ。相反，α分泌酶在Aβ之間進行切割，阻止其產(chǎn)生。以是否會產(chǎn)生Aβ作為條件進行劃分，產(chǎn)生了2種經(jīng)典途徑，分別稱為非淀粉樣肽源途徑（圖2a）和淀粉樣肽源途徑（圖2b）[10]。

圖2 2 種經(jīng)典肽源途徑

非淀粉樣肽源途徑：α分泌酶在APP胞外結(jié)構(gòu)域K687和L688之間進行切割，水解產(chǎn)生氨基端可溶性的片段sAPPα和羧基端的C83，其中sAPPα對大腦具有保護作用；γ分泌酶繼續(xù)切割C83，水解產(chǎn)生氨基端的P3和羧基端的AICD[12]。淀粉樣肽源途徑：β分泌酶在APP胞外結(jié)構(gòu)域M671和D672之間進行特異性切割，水解產(chǎn)生氨基端的sAPPβ和羧基端的C99；γ分泌酶繼續(xù)在V722和I712或A713和T714之間切割C99，水解產(chǎn)生氨基端的Aβ和羧基端的AICD，Aβ分泌到細胞外[14]。

3 APP代謝產(chǎn)物

3.1 非淀粉樣肽源途徑代謝產(chǎn)物

在α和γ分泌酶依次水解下，會產(chǎn)生sAPPα和P3肽。sAPPα包含E1區(qū)域、E2區(qū)域和一小部分C端區(qū)域。在sAPPα的4個肝素結(jié)合位點（heparin-binding sites，HBS）（96-110；131-166；316-346；382-447）中，96-110區(qū)域參與了神經(jīng)突生長的調(diào)節(jié)。在包含RERMS序列的氨基酸殘基319-335也參與了軸突的生長。并且sAPPα氨基酸殘基18-350的結(jié)構(gòu)與富含半胱氨酸的生長因子相似，這表明sAPPα在體內(nèi)起著生長因子的作用[15]。在神經(jīng)細胞方面，sAPPα能刺激胚胎腦神經(jīng)干細胞的增殖。與Aβ對神經(jīng)元的有害作用相反，sAPPα具有神經(jīng)營養(yǎng)或突觸可塑性增強特征[16]。P3是α分泌酶在Aβ上切割產(chǎn)生的一種非致病性的較短形式的Aβ，包括Aβ17-40片段或Aβ17-42片段，具有營養(yǎng)功能[17]。

3.2 淀粉樣肽源途徑代謝產(chǎn)物

sAPPβ在β分泌酶水解后釋放，包含促進神經(jīng)突起生長所需的結(jié)構(gòu)域，除了最后16個C末端氨基酸外，與sAPPα具有相同的序列。與sAPPα相比，sAPPβ不參與長時程增強（long-term potentiation，LTP）。這表明，sAPPα蛋白的最后16個C末端氨基酸參與了神經(jīng)保護和LTP。有研究證明，sAPPβ比sAPPα更有效地誘導人類胚胎干細胞神經(jīng)的快速分化。sAPPβ對軸突延長和神經(jīng)分化的影響表明，該蛋白本身不具有有害性。與sAPPα一樣，sAPPβ以同樣的效應刺激小膠質(zhì)細胞，這種效應與氨基酸殘基444上游的N端結(jié)構(gòu)域有關(guān)，是2種sAPPs共同的[15]。

Aβ是由APP經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶的順次切割產(chǎn)生，含39 ～43個氨基酸殘基。主要有Aβ40和Aβ42兩種肽，后者毒性最強[18]。

4 以代謝產(chǎn)物Aβ為靶點的治療

淀粉樣級聯(lián)假說認為，Aβ寡聚可以產(chǎn)生毒性，最終導致神經(jīng)組織受損，繼而發(fā)生疾病。因此，抑制Aβ寡聚物形成，或促進Aβ寡聚物解聚，是目前很多公司開發(fā)AD治療藥物的主要策略。

4.1 抗Aβ主動免疫療法

主動免疫是指將外源性Aβ作為抗原，刺激機體產(chǎn)生相應抗體，抗體再與內(nèi)源性Aβ結(jié)合形成抗原抗體復合物，最終被吞噬細胞清除[19]。

Elan公司生產(chǎn)的AN-1792疫苗顯著減少了AD患者大腦中Aβ的沉積，但其誘導了T細胞介導的免疫應答，導致約6%的治療患者發(fā)展為腦膜炎。目前，該項目已經(jīng)終止[20]。

CAD106也是一種主動免疫疫苗，是由來自Aβ氨基端的Aβ1-6片段的多個拷貝組成，并與佐劑載體（Qβ病毒樣顆粒）結(jié)合。CAD106產(chǎn)生的抗體可以與Aβ單體和寡聚物反應，阻斷細胞培養(yǎng)中的Aβ毒性。其目的是避免激活炎癥性T細胞，同時引發(fā)強烈的抗體反應。在2個APP轉(zhuǎn)基因小鼠系中，CAD106在沒有增加微出血或炎癥反應的情況下減少了腦Aβ的積累[21]。目前，CAD106正在一項為期5年的雙盲安慰劑對照Ⅱ/Ⅲ期研究（S1代）中進行預防性研究，該研究招募1 340名認知健康的純合APOE*ε4攜帶者。該試驗將測量MCI或AD癡呆延遲診斷的能力以及評估AD預防倡議綜合認知（the Alzheimer's Prevention Initiative Composite Cognitive，APCC）測試分數(shù)的變化。這項研究預計將于2024年5月完成[22]。

4.2 抗Aβ被動免疫療法

被動免疫是指將單克隆或多克隆人源化抗Aβ抗體注入體內(nèi)，與內(nèi)源性Aβ結(jié)合，直接誘導Aβ寡聚體分解或被吞噬細胞清除。目前正在開發(fā)5種抗體用于早期AD患者、FAD臨床前階段的患者和有AD高風險的無癥狀患者[19]。

Solanezumab是一種人源化IgG1單克隆抗體，靶向Aβ（Aβ13-28）的中心區(qū)域。識別可溶性單體Aβ，也可以與Aβ斑塊結(jié)合。Solanezumab通過結(jié)合血液和大腦中的可溶性Aβ蛋白，促使Aβ蛋白在形成不可溶性的寡聚體和淀粉樣斑之前被清除[19]。目前，該疫苗在1 150名無癥狀或輕度癥狀的老年人身上進行一項為期3年的雙盲安慰劑對照研究，觀察認知綜合量表（the Alzheimer's Disease Cooperative Study–Preclinical Alzheimer Cognitive Composite，ADCS-PACC）上的表現(xiàn)，預計將于2022年完成[23]。此外Solanezumab、Gantenerumab和β分泌酶抑制劑Atabecestat共同參與438名無癥狀或輕度癥狀的APP、PSEN1或PSEN2常染色體顯性突變攜帶者中進行的DIAN-TU試驗，以測試它們在阻止或延緩認知缺陷方面的作用，該研究將于2023年完成[19]。

Gantenerumab是一種與Aβ的氨基末端和中心區(qū)域結(jié)合的全人重組單克隆IgG1抗體。對Aβ寡聚物和Aβ纖維的親和力高，對單體Aβ的親和力較低[24]。此藥物雖未能穿過血腦屏障，但在較高劑量下具有可接受的安全性。除了參與上述Solanezumab、Atabecestat共同進行的DIAN-TU研究。還對早期AD和腦Aβ沉積的患者，采用未公開的高劑量，進行2年雙盲安慰劑對照的臨床Ⅲ期試驗（GRADUATE 1 and GRADUATE 2），預計2023年完成[19]。

Crenezumab是一種人源化抗Aβ單克隆IgG4抗體，對Aβ聚集的五聚低聚物和16 mer纖維組合特別具有親和力，也能阻止Aβ聚集，并促進其分解[25]。目前針對813例前驅(qū)至輕度AD并有腦淀粉樣病變的患者進行為期100周、雙盲、安慰劑對照的第Ⅲ階段研究（CREAD），本研究的主要目的是觀察2年內(nèi)CDR-SB評分的變化，預計在2020年9月完成。另一項對750名前驅(qū)至輕度AD（CREAD2）患者進行相同劑量的雙盲、安慰劑對照的Ⅲ期研究也在進行，該試驗將于2021年11月完成。此外，Crenezumab正在一項雙盲、安慰劑對照研究（API-ADAD）中對252名常染色體顯性遺傳PSEN1中Glu280Ala突變的前癥狀攜帶者進行預防性治療，該試驗應于2022年3月完成[19]。

Aducanumab是一種重組人IgG1抗體，識別Aβ序列的氨基末端殘基3-7，與可溶性Aβ聚集體和不溶性纖維結(jié)合，在高劑量下，可與可溶性Aβ單體結(jié)合[26]。2項為期18個月、雙盲、安慰劑對照的第Ⅲ期臨床試驗（ENGAGE和EMERGE）目前分別招收1 350名前驅(qū)性AD和陽性淀粉樣PET掃描患者，按1：1：1的比例隨機分配，接受低劑量Aducanumab、高劑量Aducanumab或安慰劑治療18個月，并有可能接受24個月的長期延長治療。主要觀察CDR-SB評分從基線到第78周的變化，預計研究將于2022年12月完成[19]。

4.3 β分泌酶抑制劑

β分泌酶有很多種類，其中與Aβ生成密切相關(guān)的是天冬氨酸蛋白酶1（β-secretase 1，BACE1），BACE1介導的APP裂解是Aβ產(chǎn)生的第一步。許多研究表明，抑制蛋白酶BACE1的表達，可以有效減少腦內(nèi)Aβ的生成或降低體內(nèi)Aβ水平。但目前很少有BACE抑制劑處于第Ⅲ期臨床開發(fā)，因為其中有些對人類有毒性而被拋棄[19]。

Verubecestat是一種口服BACE1抑制劑，對BACE1具有納米親合性，但對BACE2不具有納米親合性[27]。EPOCH試驗對1 958例輕中度AD患者進行了為期78周的雙盲安慰劑對照Ⅱ/Ⅲ期研究，評估了每天12、40 mg和60 mg Verubecestat的安全性和有效性。但是沒有預先篩選存在腦淀粉樣蛋白的患者，這項研究在預定完成前5個月因無效而終止[28]。在另一項為期104周的雙盲安慰劑對照研究（APECS）中，對1 500名患有前驅(qū)性AD或輕度認知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）的患者分別進行了每天12 mg和40 mg劑量的Verubecestat測試，這些患者的PET掃描呈陽性。由于不利的風險-效益比，該試驗提前終止。可以表明用Verubecestat治療后的患者會出現(xiàn)認知惡化[19]。

Lanabecestat是一種口服的長效BACE1抑制劑，在I期和Ⅱa階段的研究中，Lanabecestat對腦脊液Aβ1-42產(chǎn)生長期和劑量依賴性的抑制作用[19]。一項為期2年、雙盲、安慰劑對照的Ⅱ/Ⅲ期研究（AMARANTH）評估了2 202名輕度AD或MCI患者，但由于這項研究在完成后不能達到其主要終點，所以以無效告終[29]。

Elenbecestat是一種BACE1抑制劑，已被證明能降低大鼠、豚鼠和非人類靈長類動物大腦和腦脊液中的Aβ濃度。目前2項24個月、雙盲、安慰劑對照的Ⅲ期研究（MISSION AD1和MISSION AD2）正在進行中。這2項研究都招募了1 330名有腦淀粉樣病變的MCI或輕度AD患者，每天接受50 mg Elenbeestat或安慰劑，主要結(jié)果是CDR-SB評分。預計結(jié)果將于2021年3月公布[19]。

Atabecestat是一種非選擇性口服BACE1抑制劑，劑量依賴性地降低大鼠和猴的腦脊液Aβ水平[19]。在對健康志愿者使用單次和多次遞增Atabecestat劑量的2個I期研究中，觀察到腦脊液Aβ1–40水平的劑量依賴性降低[30]。Atabecestat也在前述的DIAN-TU研究中進行了評估，目前尚不清楚該藥物是否已從該研究中撤出[19]。

CNP520是一種口服、長效、選擇性的BACE1抑制劑，具有良好的腦滲透性，可使大鼠腦內(nèi)Aβ水平降低80%以上[19]。一項為期13周、雙盲、安慰劑對照的Ⅱ期研究（S1代）評估了125名健康老年人服用不同劑量的CNP520與安慰劑的情況，研究將測試CNP520延遲診斷MCI的能力，并提高APCC測試分數(shù)。預計結(jié)果將在2024年9月公布。還有一項類似的5年、雙盲、安慰劑對照、Ⅱ/Ⅲ期研究（S2代），招募2 000名60 ～75歲認知健康、純合子或雜合子APOE*ε4攜帶者，主要結(jié)果是MCI的診斷和APCC測試分數(shù)。該研究應于2024年8月完成[31]。

綜上所述，β淀粉樣假說是AD中重要的假說之一，近年來以Aβ為藥物靶點治療AD的研究取得了較大進展，很多有潛力的藥物已進入Ⅲ期臨床試驗。然而目前還沒有臨床試驗能證明抗Aβ療法的有效性，所以應該根據(jù)試驗失敗的原因如藥物的安全性、血腦屏障通透性和患者的耐受性等方面去尋找相應的解決辦法，更好地發(fā)揮人工抑制劑對毒性Aβ的抑制效果，為今后AD藥物的研發(fā)提供參考和思路。而且AD是一種多因素參與的疾病，隨著對AD發(fā)病機制的深入研究和各種藥物的不斷完善，相信可以找到未來防治AD的有效模式和藥物，為AD患者帶來希望。