艾合買(mǎi)提江·艾海提 謝有強(qiáng) 陳智全

我國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家之一，盡管手術(shù)、放化療、分子靶向治療等治療手段不斷提高，胃癌患者的生存率仍不令人滿(mǎn)意[1,2]。近年來(lái)，許多原癌基因和抑癌基因被證實(shí)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。因此，進(jìn)一步闡明胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)提高胃癌患者的診斷、治療和預(yù)后具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是新近發(fā)現(xiàn)非編碼RNA家族成員，其長(zhǎng)度>200 nt并缺乏蛋白編碼功能[3]。研究表明，lncRNAs通過(guò)在不同程度上調(diào)控基因表達(dá)，參與對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移和致瘤性等過(guò)程的調(diào)控[4,5]。lncRNA葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域包含蛋白1內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1(Staphylococcal nuclease and Tudor domain containing 1 gene intron transcript 1，SND1-IT1)是新近發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，研究顯示lnc SND1-IT1高表達(dá)可提高骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力[6]。但SND1-IT1在胃癌進(jìn)展中的作用尚不明確。因此，本研究通過(guò)觀察lnc SND1-IT1在胃癌中的表達(dá)及其生物學(xué)作用，揭示其分子機(jī)制，為胃癌的治療提供潛在策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人胃黏膜上皮正常細(xì)胞GES-1、胃癌細(xì)胞AGS、HGC-27和Hs 746T購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM、F-12、RPMI-1640、胎牛血清、青鏈霉素溶液購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；lnc SND1-IT1小干擾RNA(si-lnc SND1-IT1)及其對(duì)照(si-con)、miR-185-5p模擬物(miR-185-5p mimics)及其對(duì)照(miR-con)、miR-185-5p抑制物(anti-miR-185-5p)及其對(duì)照(anti-miR-con)、lnc SND1-IT1過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-lnc SND1-IT1)及其對(duì)照(pcDNA)、PCR引物由上海吉瑪制藥有限公司完成；TRIzol試劑、Lipfectamine 2000購(gòu)于美國(guó)Ivitrogen公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell count kit 8，CCK-8)、放射免疫沉淀測(cè)定(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)BD公司；兔抗人細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)抗體、兔抗人周期蛋白依賴(lài)性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)抗體、兔抗人MMP-9抗體、山羊抗兔IgG購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) GES-1細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，AGS細(xì)胞在F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HGC-27和Hs 746T細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素溶液，均置于37℃、含5% CO2的濕潤(rùn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)期AGS細(xì)胞2×105cells/孔接種到6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將si-con、si-lnc SND1-IT1、miR-con、miR-185-5p mimics、si-lnc SND1-IT1+anti-miR-con和si-lnc SND1-IT1+anti-miR-185-5p分別轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)lnc SND1-IT1和miR-185-5p的表達(dá) 采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度。取適量RNA利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后利用SYBR Green master mix試劑盒進(jìn)行qPCR。按照2-ΔΔCt法檢測(cè)lnc SND1-IT1和miR-185-5p的表達(dá)。SND1-IT1上游5’-CCTGAGCGGCAGATCAACC-3’，下游5’-AGGTAGATCATGCCATACTCTCG-3’；β-actin上游5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，下游5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’； miR-185-5p上游5’-TGAGGAGCCGATCACGTC-3’，下游5’-GTGCCGGTGCAGAGGT-3’；U6上游5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAAC-3’，下游5’-GCTTCACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3’。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，將AGS細(xì)胞按照2.5×103cells/孔96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，每孔添加10 μl的CCK-8試劑孵育1 h，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的光密度值(A)。

1.6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，將AGS細(xì)胞懸浮于無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液中，取1×105cells/300 μl接種到鋪有基質(zhì)膠的transwell小室，24孔板下室內(nèi)加入600 μl含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出transwell小室，4%多聚甲醛固定下室膜20 min，0.5%結(jié)晶紫溶液染色后，顯微鏡下觀察細(xì)胞過(guò)膜情況，拍照和計(jì)數(shù)，以均值表示侵襲細(xì)胞數(shù)目。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)采用未鋪有基質(zhì)膠的transwell小室，其他步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.7 蛋白質(zhì)印記檢測(cè)CyclinD1、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá) 采用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA法進(jìn)行定量。將蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上后，于5%的脫脂牛奶中孵育2 h，洗膜后，置于稀釋的一抗溶液中4℃孵育過(guò)夜，洗膜后，置于稀釋的二抗溶液中室溫條件下孵育2 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色后，并通過(guò)圖像軟件分析各目的條帶的灰度值。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 含有miR-185-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型(WT-SND1-IT1)或突變位點(diǎn)的突變型(MUT-SND1-IT1)熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建由上海吉瑪制藥有限公司完成。將miR-185-5p mimics、miR-NC分別與WT-SND1-IT11或MUT-SND1-IT1共轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 lnc SND1-IT1和miR-185-5p人胃黏膜上皮正常細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中的表達(dá) 與人胃黏膜上皮正常細(xì)胞GES-1比較，胃癌細(xì)胞AGS、HGC-27和Hs 746T中l(wèi)nc SND1-IT1的表達(dá)明顯增加，miR-185-5p的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。選擇胃癌細(xì)胞AGS進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表1。

表1 lnc SND1-IT1 和miR-185-5p在人胃黏膜上皮正常細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 沉默lnc SND1-IT1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與轉(zhuǎn)染si-con比較，轉(zhuǎn)染si-lnc SND1-IT1后AGS細(xì)胞lnc SND1-IT1的表達(dá)明顯降低，CyclinD1、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞增殖率顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 Western blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的表達(dá)和Transwell檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲

表2 沉默lnc SND1-IT1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 lnc SND1-IT1靶向調(diào)控miR-185-5p 采用Starbase在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)lnc SND1-IT1可直接靶向miR-185-5p。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者靶向關(guān)系顯示，與miR-con和WT-SND1-IT1共轉(zhuǎn)染相比，miR-185-5p mimics和WT-SND1-IT1共轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而與miR-con和MUT-SND1-IT1共轉(zhuǎn)染相比，miR-185-5p mimics和MUT-SND1-IT1共轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化。RT-qPCR顯示，與轉(zhuǎn)染si-con相比，轉(zhuǎn)染si-lnc SND1-IT1后AGS細(xì)胞miR-185-5p的表達(dá)明顯升高；與轉(zhuǎn)染pcDNA相比，轉(zhuǎn)染pcDNA-lnc SND1-IT1后AGS細(xì)胞miR-185-5p的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。說(shuō)明lnc SND1-IT1靶向并負(fù)調(diào)控miR-185-5p表達(dá)。見(jiàn)圖2，表3、4。

圖2 lnc SND1-IT1與miR-185-5p存在靶向序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表4 lnc SND1-IT1調(diào)控miR-185-5p表達(dá)

2.4 過(guò)表達(dá)miR-185-5p抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 與轉(zhuǎn)染miR-con比較，轉(zhuǎn)染miR-185-5p mimics后AGS細(xì)胞miR-185-5p的表達(dá)明顯升高，CyclinD1、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞增殖率顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表5。

表5 過(guò)表達(dá)miR-185-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖3 Western blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的表達(dá)

2.5 沉默lnc SND1-IT1和干擾miR-185-5p對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用 與共轉(zhuǎn)染si-lnc SND1-IT1和anti-miR-con比較，共轉(zhuǎn)染si-lnc SND1-IT1和anti-miR-185-5p后AGS細(xì)胞miR-185-5p的表達(dá)明顯降低，CyclinD1、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)明顯升高，細(xì)胞增殖率顯著升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表6，圖4。

表6 沉默lnc SND1-IT1和干擾miR-185-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 Western blot檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的表達(dá)

3 討論

lncRNAs表異常達(dá)影響其在表觀遺傳水平上的調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲異常，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，有效控制細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲是緩解腫瘤進(jìn)展和進(jìn)一步提高治療效果的關(guān)鍵。Wang等[7]證實(shí)lncRNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本2(colon cancer associated transcript 2，CCAT2)高表達(dá)與胃癌患者腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)，高表達(dá)胃癌患者預(yù)后較差，總生存期較短。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化(activated by transforming growth factor-β，ATB)lncRNA在胃癌中也呈高表達(dá)，其高表達(dá)與侵襲深度增加、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及晚期腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，下調(diào)lncRNA ATB抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。本研究顯示胃癌細(xì)胞中l(wèi)nc SND1-IT1表達(dá)較人胃黏膜上皮正常細(xì)胞顯著增加，進(jìn)一步功能分析顯示沉默lnc SND1-IT1后胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯降低，與lnc SND1-IT1在骨肉瘤中的作用一致[6]。然而，在鱗狀細(xì)胞癌中l(wèi)nc SND1-IT1呈低表達(dá)[9]，這可能與lnc SND1-IT1在不同腫瘤細(xì)胞中作用不同有關(guān)。CyclinD1是細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白，其通過(guò)與CDKs結(jié)合，促進(jìn)底物Rb磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞DNA合成，從而使細(xì)胞周期進(jìn)入S期，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞獲得無(wú)限制增殖能力[10]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的關(guān)鍵成員，其通過(guò)降解胞外基質(zhì)在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有重要作用，其高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲性表型相關(guān)[11]。本研究顯示，沉默lnc SND1-IT1后CyclinD1、CDK2、MMP-2和MMP-9表達(dá)顯著降低，與功能分析結(jié)果相吻合。以上結(jié)果說(shuō)明，沉默lnc SND1-IT1可降低胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

lncRNA通過(guò)發(fā)揮miRNA分子海綿作用是其調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的重要機(jī)制[12]。本研究采用生物信息學(xué)軟件starbase進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-185-5p是lnc SND1-IT1的潛在靶基因。RT-qPCR分析胃癌細(xì)胞中miR-185-5p表達(dá)發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞中miR-185-5p表達(dá)下調(diào)，與lnc SND1-IT1表達(dá)模式呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證二者靶向關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-185-5p是lnc SND1-IT1的靶基因，且lnc SND1-IT1負(fù)調(diào)控miR-185-5p表達(dá)。miR-185-5p已被證實(shí)在前列腺癌、膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用[13,14]。在前列腺癌和肝癌中miR-185-5p表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-185-5p可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力[15,16]。與上述研究結(jié)論類(lèi)似，本研究顯示過(guò)表達(dá)miR-185-5p可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。此外，過(guò)表達(dá)miR-185-5p還可抑制CyclinD1、CDK2、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平。進(jìn)一步恢復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，干擾miR-185-5p表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)沉默lnc SND1-IT1對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用。于是本研究推測(cè)胃癌中l(wèi)nc SND1-IT1過(guò)表達(dá)可能通過(guò)干擾miR-185-5p表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究首次證實(shí)lnc SND1-IT1和miR-185-5p在胃癌中的作用，即胃癌細(xì)胞中l(wèi)nc SND1-IT1表達(dá)上調(diào)，miR-185-5p表達(dá)下調(diào)，沉默lnc SND1-IT1通過(guò)靶向miR-185-5p可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。因此，lnc SND1-IT1和miR-185-5p有望成為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。