方 燕，陳建歐，鄭旭旭

(溫州市中醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325000)

卵巢癌是女性發(fā)生率較高的生殖器官惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于宮頸癌及子宮體癌[1]。目前，臨床上對于卵巢癌發(fā)病機(jī)制尚未闡明，普遍認(rèn)為與遺傳因素、內(nèi)分泌因素等有關(guān)，臨床表現(xiàn)多以疼痛為主，部分患者可伴有下腹包塊、月經(jīng)不調(diào)等[2]。PTEN基因是除p53基因外的第二大抑癌基因，主要定位于在10號染色體上，具有雙重特異性[3]。研究表明，PTEN的脂質(zhì)磷酸酶活性拮抗磷脂酰肌醇-3-激酶(PIEK)/AKT/mTOR途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長和存活[4]。故PTEN的突變與缺失能參與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞周期的停止，且PTEN基因的低表達(dá)或缺失與腫瘤的進(jìn)展和不良預(yù)后存在相關(guān)性。此前研究證據(jù)提示，PTEN基因突變及表達(dá)能直接參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，能通過多種途徑調(diào)控細(xì)胞的增殖與遷移[5]。因此，本研究以卵巢癌及良性上皮性卵巢腫瘤患者為對象，探討卵巢癌患者PTEN基因突變情況、mRNA表達(dá)水平及其對卵巢癌的臨床診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2016年1月至2020年2月在溫州市中醫(yī)院進(jìn)行診治的卵巢癌患者58例為觀察組，觀察組年齡介于28～52歲，平均年齡(35.79±5.73)歲；腫瘤直徑介于2～7cm，平均直徑(4.34±0.63)cm；組織學(xué)分型為：漿液性囊腺癌21例，粘液性囊腺癌18例，卵巢內(nèi)膜性癌14例，透明細(xì)胞癌5例；組織分化程度為：高分化7例，中分化37例，低分化14例；臨床分期為：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期24例。選擇同期進(jìn)行治療的良性上皮性卵巢腫瘤患者71例為對照組，對照組年齡介于29～53歲，平均年齡(36.11±5.74)歲。研究對象的納入標(biāo)準(zhǔn)為：①符合卵巢癌和良性上皮性卵巢腫瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②均行手術(shù)治療，術(shù)中留取病灶組織；③均完成PTEN基因突變及mRNA水平測定，且患者均可耐受；④對本研究知情且同意參加者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并認(rèn)知功能異常、自身免疫系統(tǒng)疾病者；②患者留取病灶組織前已接受激素或放化療治療；③合并精神異常、其他部位腫瘤或嚴(yán)重肝腎功能異常者。經(jīng)對比，兩組患者的一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。本研究方案已經(jīng)由溫州市中醫(yī)院倫理委員會審核及批準(zhǔn)，且所有研究對象均已簽署知情同意書。

1.2檢測方法

1.2.1 PENT基因突變測定

所有患者均行手術(shù)治療，且術(shù)中留取病灶組織，并將獲得的組織立即放置在液氮中，完成30min速凍后，將其放置在-70℃冰箱中；部分病灶組織采用濃度為10.0%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后，制備4μm切片備用。采用實時熒光定量PCR技術(shù)完成不同組織中PTEN基因突變部位，并完成擴(kuò)增，正向引物：5′-TCCAATAGAAAAATGGTG-3′；反向引物：5′-TGCCCCGATGTAATAAAT-3′；引物長度196nt。取上述經(jīng)PCR擴(kuò)增的引物3μL，根據(jù)1∶5的比例放置在變性劑(含有甲酰胺98.0%、NaOH溶液200mmol/L、EDTA 20mmol/L、溴酚藍(lán)0.05%及二甲苯青0.05%)中充分混合，在98℃下完成10min變性，完成后立即完成5min水浴。取上述獲得的混合溶液，完成聚丙烯酰胺凝膠電泳，從而獲得銀染顯帶，將DNA異常的擴(kuò)增產(chǎn)物送外檢，完成相應(yīng)序列的測定[7]。

1.2.2 PENT mRNA表達(dá)水平測定

取上述分離的組織標(biāo)本，向標(biāo)本中加入Trizol 500μL，充分混合后轉(zhuǎn)移到離心管1.0mL，振蕩5min后，靜置。向各組標(biāo)本中加入氯仿200μL，振蕩15s，靜置5min后離心15min，離心速度12 000rpm。完畢后加入預(yù)冷的乙醇(濃度為75.0%)1mL，常溫下放置7min至干燥，經(jīng)紫外分光度儀A260下測定吸光度值。采用實時熒光定量PCR技術(shù)測定各組樣品中PENTmRNA的表達(dá)水平。根據(jù)實驗需要完成PCR參數(shù)設(shè)置：30℃下10min；42℃下30min；99℃下5min；5℃下5min，合計完成循環(huán)35個，72℃下10min延長，獲得最終產(chǎn)物并放入1.5%瓊脂凝膠電泳，β-actin為內(nèi)對照，引物見表1[8]。

表1 PTEN mRNA引物設(shè)計

1.3觀察指標(biāo)

①觀察卵巢癌組織中PTEN基因突變情況；②對比觀察組和對照組的PTEN mRNA水平差異；③收集患者的年齡、病理類型、分化類型及臨床分期，比較觀察組不同年齡、分化類型、病理組織類型及臨床分期下PTEN mRNA水平差異；④繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線，分析PTEN mRNA水平在卵巢癌患者中的診斷效能。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1 卵巢癌組織中PTEN基因突變

58例卵巢癌組織中，有35例檢出PTEN基因突變，均為外顯子5突變，多分布在中分化及低分化癌中；其中卵巢內(nèi)膜性癌11例，透明細(xì)胞癌4例，漿液性囊腺癌13例，粘液性囊腺癌7例。突變部位為外顯子5第5位密碼子T→C，見圖1。

注：突變部位為PTEN基因外顯子5第5位密碼子T→C。

2.2兩組患者PTEN mRNA水平的比較

觀察組PTEN mRNA水平為顯著低于對照組(0.334±0.097 vs 0.831±0.109，t=6.391，P<0.001)，見表2。

表2 兩組PTEN mRNA水平的比較

2.3不同病理特征下卵巢癌患者的PTEN mRNA表達(dá)水平

不同年齡分層下，卵巢癌患者的PTEN mRNA水平無顯著差異(t=0.334，P=0.691)。不同分化類型及病理組織類型分層下，卵巢癌患者的PTEN mRNA水平分布具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(F=7.891、7.998，P<0.001)臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的卵巢癌患者PTEN mRNA水平顯著高于Ⅲ～Ⅳ期患者(t=6.143，P<0.001)，見表3。

表3 不同病理特征下卵巢癌患者的PTEN mRNA表達(dá)水平比較

2.4 PTEN mRNA水平對卵巢癌的診斷價值

ROC曲線結(jié)果顯示，PTEN mRNA水平診斷卵巢癌的AUC為0.873(P<0.05),最優(yōu)截斷點的診斷靈敏度和特異度分別為85.71%、71.23%，見圖2。

圖2 PTEN mRNA水平診斷卵巢癌的ROC曲線

3討論

3.1 PTEN基因在卵巢癌細(xì)胞中的突變

卵巢癌是女性發(fā)生率較高的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于宮頸癌、子宮癌，具有較高的死亡率[9]。既往研究表明[10]，惡性腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡存在緊密的聯(lián)系。PTEN基因?qū)儆谌梭w中較為常見的抑癌基因，位于染色體10q23，含9個外顯子和8個內(nèi)含子，其編碼的蛋白與張力蛋白、輔助蛋白相似[11]。既往研究表明[11]，PTEN基因編碼的蛋白能提高相關(guān)蛋白活性，能影響磷酸絲氨酸/蘇氨酸和磷酸酪氨酸殘基脫磷酸化，可負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動、浸潤與轉(zhuǎn)移。此外，PTEN還具有脂質(zhì)磷酸酶活性，通過一系列作用使細(xì)胞周期阻滯在G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。PTEN基因能借助多種信號通路、途徑等抑制細(xì)胞的增殖活性，故其突變多與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究中，58例卵巢癌組織中檢出35例攜帶PTEN基因突變，多分布在中分化、低分化癌中，且均為外顯子5突變。此前研究證據(jù)也表明，PTEN基因外顯子5突變將改變編碼產(chǎn)物的磷酸酶結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而使其功能異常[13]。

3.2 PTEN mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)及意義

本研究結(jié)果顯示，觀察組PTEN mRNA水平低于對照組(P<0.05)，說明PTEN基因在卵巢癌患者中呈低表達(dá)水平。且本研究還發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中PTEN mRNA表達(dá)水平與患者的分化類型、病理組織類型及臨床分期密切相關(guān)，低分化、Ⅲ～Ⅳ期及卵巢內(nèi)膜性癌患者的PTEN mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示其表達(dá)水平或可反映患者的疾病嚴(yán)重程度，可用于輔助判斷患者的病理分型、分化程度及臨床分期，進(jìn)而用于指導(dǎo)臨床診療。且本研究結(jié)論與此前類似研究結(jié)論較為一致[14]。其原因可能降低細(xì)胞粘附和凋亡、提高細(xì)胞運(yùn)動性和增值、促進(jìn)心血管形成等過程相關(guān)[12]。但仍需開展更多大樣本研究，進(jìn)一步明確PTEN mRNA表達(dá)水平與患者的分化類型、病理組織類型及臨床分期的量化關(guān)系，助力卵巢癌個體化治療。

3.3 PTEN mRNA水平對卵巢癌的診斷價值

為了進(jìn)一步分析PTEN mRNA對卵巢癌的診斷價值，本研究進(jìn)一步構(gòu)建ROC曲線，結(jié)果顯示，PTEN mRNA水平診斷卵巢癌的AUC為0.873(P<0.05)，最優(yōu)截斷點的診斷靈敏度和特異度分別為85.71%、71.23%，提示較高的診斷價值。故臨床上應(yīng)加強(qiáng)卵巢癌患者的PTEN基因測定，以便于評估患者分期、疾病嚴(yán)重程度，并根據(jù)測定結(jié)果制定治療方案，促進(jìn)患者恢復(fù)。

綜上所述，卵巢癌患者常伴有PTEN基因突變，該基因mRNA水平可能因分化類型、病理組織類型及臨床分期的分布而異，且對卵巢癌的診斷具有重要價值，有望成為卵巢癌治療的新靶點。