孫賢 姜宏 劉迎春 倪豐 朱杰
1安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍臨床學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心(合肥230031);2中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901 醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心(合肥230031)
三十年前澳大利亞學(xué)者首次實(shí)現(xiàn)凍融卵母細(xì)胞妊娠和活產(chǎn)[1],為凍融卵母細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。玻璃化冷凍技術(shù)較傳統(tǒng)的程序化慢速冷凍技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快捷、不需要昂貴的程序化冷凍儀等優(yōu)點(diǎn),并可顯著提高凍融卵母細(xì)胞及胚胎的復(fù)蘇率和發(fā)育潛能,改善其臨床結(jié)局,已廣泛應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)領(lǐng)域[2-3]。由于卵母細(xì)胞自身的形態(tài)學(xué)特點(diǎn),其冷凍復(fù)蘇率及復(fù)蘇后的發(fā)育潛能遠(yuǎn)低于精子及胚胎,但隨著玻璃化冷凍技術(shù)的發(fā)展,卵母細(xì)胞的冷凍復(fù)蘇率大幅提高,已從最初主要應(yīng)用于女性患者放、化療前的生育力保存,拓展到實(shí)施ART 過(guò)程中取卵日因各種原因無(wú)法獲得可用精子的被動(dòng)卵母細(xì)胞冷凍,以及因延遲生育進(jìn)行女性生育能力保存的主動(dòng)卵母細(xì)胞冷凍,成為ART 的重要組成部分[2,4]。
目前卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)雖已在全國(guó)各大中心相繼開(kāi)展,但其臨床應(yīng)用遠(yuǎn)不及精子及胚胎,筆者通過(guò)回顧性分析本中心卵母細(xì)胞玻璃化冷凍患者的臨床結(jié)局,旨在探討凍融卵母細(xì)胞單精子注射-胚胎移植(intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer,ICSI-ET)的可行性、安全性及臨床價(jià)值。
1.1 研究對(duì)象與分組回顧性分析2013年1月-2019年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍臨床學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心行凍融卵母細(xì)胞ICSI-ET 共113 個(gè)周期的臨床資料,將其設(shè)為凍卵組,按1:3 比例隨機(jī)抽取同期行新鮮周期ICSI-ET 共339 個(gè)周期作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡<40 歲,F(xiàn)SH<10 mIU/mL,AMH>1.1 ng/mL;(2)移植胚胎均為卵裂胚;(3)取卵周期數(shù)≤2 次。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)男、女任一方染色體異常;(2)盆腔結(jié)核;(3)嚴(yán)重子宮內(nèi)膜異位癥;(4)復(fù)發(fā)性流產(chǎn);(5)宮腔粘連;(6)高泌乳素血癥;(7)合并嚴(yán)重全身性疾病及內(nèi)分泌疾病。
1.2 方法
1.2.1 控制性促排卵(controlled ovarian stimulation,COS)方案包括拮抗劑、長(zhǎng)方案、微刺激、高孕激素降調(diào)及黃體期促排卵方案,結(jié)合陰道B超和血清FSH、LH、E2、P 水平監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況,適時(shí)調(diào)整促性腺激素(Gn)劑量,當(dāng)2 個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm 或3 個(gè)≥17 mm 時(shí),皮下注射人絨毛膜促性腺激素(hCG,艾澤,默克雪蘭諾,意大利)250 μg,36 h 后B 超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。
1.2.2 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍采用日本加藤公司冷凍試劑盒對(duì)卵母細(xì)胞行玻璃化冷凍,冷凍方法參照操作說(shuō)明適當(dāng)調(diào)整。將成熟(MII)卵母細(xì)胞置入冷凍試劑1(ES)中6~8 min,期間觀察卵胞漿在ES 中的形態(tài)變化,待卵胞漿完全恢復(fù)進(jìn)行下一步。如10 min 形態(tài)仍未恢復(fù)可延長(zhǎng)ES 作用時(shí)間,但不超過(guò)15 min,隨即將卵母細(xì)胞移入冷凍試劑2(VS)中平衡1 min,裝載入冷凍載桿,快速投入液氮。
1.2.3 卵母細(xì)胞解凍激素替代(hormone replace treatment,HRT)周期內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日行卵母細(xì)胞復(fù)蘇,按照操作說(shuō)明進(jìn)行。將卵母細(xì)胞依次置入解凍試劑1(TS):1 min,解凍試劑2(DS):3 min,解凍試劑3(WS1):5 min,解凍試劑4(WS2):5 min。之后轉(zhuǎn)入G-IVFPLUS 中孵育2 h。
1.2.4 解凍卵母細(xì)胞的存活標(biāo)準(zhǔn)解凍后存活卵母細(xì)胞在鏡下均勻透亮、透明帶完整、質(zhì)膜無(wú)破裂、胞質(zhì)無(wú)變性固縮及外流、卵周間隙均勻存在且無(wú)明顯增寬或消失、有立體折光;死亡卵母細(xì)胞外觀暗淡無(wú)光、體積增大、質(zhì)膜邊界不清、胞質(zhì)變性或固縮、無(wú)立體折光。
1.2.5 授精采用ICSI 方式對(duì)存活MII 卵母細(xì)胞授精,培養(yǎng)18 h 后觀察卵母細(xì)胞受精情況,D3 進(jìn)行卵裂胚觀察和評(píng)分??衫门咛ザx為D3 正常受精且5 個(gè)卵裂球Ⅲ級(jí)以上胚胎,優(yōu)質(zhì)胚胎定義為D3 正常受精且7 個(gè)卵裂球Ⅱ級(jí)以上胚胎。
1.2.6 子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備凍卵組采用HRT 方案準(zhǔn)備內(nèi)膜,月經(jīng)周期第2 ~3 天口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè))4 ~6 mg/d,當(dāng)內(nèi)膜厚度≥8 mm 時(shí),肌肉注射黃體酮注射液40 mg/日或黃體酮凝膠1.25 mg/日(納陰)轉(zhuǎn)化內(nèi)膜,轉(zhuǎn)化內(nèi)膜第4 天進(jìn)行胚胎移植,并繼續(xù)黃體支持。對(duì)照組于取卵后D3 進(jìn)行胚胎移植,黃體支持方案同凍卵組。
1.2.7 胚胎移植及妊娠結(jié)局選擇1 ~3 枚D3 可利用胚胎移植(其中移植3 枚胚胎者均在2017年之前且前一周期種植失敗或年齡>35 歲),移植后30 ~35 d 陰道超聲見(jiàn)孕囊定義為臨床妊娠,確診為宮內(nèi)妊娠后,隨訪并記錄臨床結(jié)局。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或百分率(%)表示,計(jì)量資料組間比較用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料組間比較用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍原因分析本研究113個(gè)凍卵周期共凍存卵母細(xì)胞1 268 枚,凍卵原因包括取卵日男方無(wú)活精子(包括睪丸附睪穿刺未獲得精子)、男方取精失敗且拒絕睪丸附睪穿刺、取卵日家庭意外(親屬病亡、交通事故及家庭矛盾等)而行被動(dòng)冷凍;女方獲卵數(shù)較多(≥25 枚),對(duì)部分卵母細(xì)胞(6 ~20 枚)行主動(dòng)冷凍,見(jiàn)表1。
表1 卵母細(xì)胞冷凍原因分析Tab.1 Analysis of the causes of oocyte vitrification
2.2 患者基本情況由表2 可見(jiàn),兩組間平均年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、基礎(chǔ)FSH 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
表2 兩組患者基本資料Tab.2 Basic data of patients between the two groups±s
表2 兩組患者基本資料Tab.2 Basic data of patients between the two groups±s
指標(biāo)周期數(shù)(個(gè))女方年齡(歲)BMI(kg/m2)不孕年限(年)基礎(chǔ)FSH(mIU/mL)凍卵組113 29.56±4.32 22.59±3.67 4.16±2.59 7.34±2.12對(duì)照組339 29.99±4.40 23.00±3.53 4.54±3.27 7.40±1.80 t 值/-0.899-1.050-1.271-0.276 P 值/0.369 0.294 0.205 0.783
2.3 兩組體外受精結(jié)果比較由表3 可見(jiàn),1 268枚冷凍卵母細(xì)胞解凍后存活1 087 枚,復(fù)蘇率為85.73%。凍卵組的卵裂率、D3 優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),兩組間受精率、D3 可移植胚胎率、移植優(yōu)質(zhì)胚胎率、移植胚胎數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
表3 兩組體外受精結(jié)果比較Tab.3 Comparison of in vitro fertilization results between the two groups
2.4 臨床及新生兒結(jié)局比較凍卵組113 個(gè)周期行ICSI 后有可移植胚胎周期92 個(gè),無(wú)可移植胚胎周期21 個(gè),周期取消率為18.58%(21/113);對(duì)照組339 個(gè)周期行ICSI 后有可移植胚胎周期306 個(gè)(行新鮮胚胎移植222 個(gè)周期,因預(yù)防OHSS、孕酮>1.5 ng/mL 等原因行全胚冷凍84 個(gè)周期),無(wú)可移植胚胎周期33 個(gè),占9.73%(33/339),無(wú)可移植胚胎周期率顯著低于凍卵組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(9.73%vs.18.58%,P<0.05),兩組間種植率、臨床妊娠率、異位妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、平均分娩孕周、平均新生兒出生體重及出生缺陷率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。
表4 兩組患者臨床及新生兒結(jié)局比較Tab.4 Comparison of clinical and neonatal outcomes between the two groups±s,%
表4 兩組患者臨床及新生兒結(jié)局比較Tab.4 Comparison of clinical and neonatal outcomes between the two groups±s,%
注:*P <0.05
指標(biāo)移植周期數(shù)(個(gè))無(wú)可移植胚胎周期率(%)種植率(%)臨床妊娠率(%)異位妊娠率(%)流產(chǎn)率(%)活產(chǎn)率(%)平均分娩孕周(images/BZ_18_2163_439_2190_484.png±s,周)平均新生兒出生體重(images/BZ_18_2163_439_2190_484.png±s,g)出生缺陷率(%)凍卵組92 18.58(21/113)25.12(51/203)43.48(40/92)0 22.50(9/40)33.70(31/92)38.31±2.36 3 217.35±626.05 0對(duì)照組222 9.73(33/339)27.53(128/465)47.30(105/222)0 15.24(16/105)40.09(89/222)38.31±2.27 3 093.16±578.63 0 t/χ2值/6.309 0.416 0.382/1.071 1.126-0.002 1.067/P值/0.012*0.519 0.537/0.301 0.289 0.998 0.288/
既往卵母細(xì)胞冷凍多用于卵巢功能不全、惡性腫瘤放化療前、子宮內(nèi)膜異位癥及各種原因推遲生育女性的生育能力保存[5-8]。但在IVF-ET 周期中常遇到因取卵日男患者取精失敗或未獲得活精子,需實(shí)施卵母細(xì)胞緊急冷凍的情況[9-10]。本研究的結(jié)果顯示,該原因占本中心卵母細(xì)胞冷凍的64.60%,是實(shí)施被動(dòng)卵母細(xì)胞冷凍的主要原因。該情況下,采取緊急卵母細(xì)胞冷凍策略,不僅可減輕患者的心理及精神負(fù)擔(dān),還可節(jié)約治療費(fèi)用。2013年美國(guó)已有50%以上的生殖中心實(shí)施卵母細(xì)胞冷凍技術(shù),其中因醫(yī)療因素占18%,并將其列為成熟的臨床應(yīng)用項(xiàng)目,在臨床廣泛應(yīng)用[2,4]。
對(duì)于高齡女性生育群體、高齡失獨(dú)、罹患腫瘤及卵巢功能不全女性,由于其卵巢儲(chǔ)備功能下降及卵母細(xì)胞質(zhì)量異常,常難以通過(guò)自身卵母細(xì)胞獲得子代,冷凍卵母細(xì)胞捐贈(zèng)是該類患者獲得子代的有效途徑。本研究共對(duì)36 例獲卵數(shù)較多(≥25 枚)患者實(shí)施主動(dòng)卵母細(xì)胞冷凍,占全部卵母細(xì)胞冷凍的31.86%。與精子相比卵母細(xì)胞更為稀缺和珍貴,且國(guó)內(nèi)尚無(wú)卵子庫(kù),因此對(duì)IVF 過(guò)程中部分年輕且獲卵數(shù)較多的患者凍存部分卵母細(xì)胞,不僅可為患者本人提供生育保險(xiǎn),同時(shí)可有效避免大量剩余胚胎的浪費(fèi),為有贈(zèng)卵需求的不孕患者提供較高質(zhì)量的卵源。
實(shí)現(xiàn)活產(chǎn)所需的冷凍卵母細(xì)胞數(shù)量是生殖醫(yī)學(xué)工作者和患者共同關(guān)注的問(wèn)題。有研究表明活產(chǎn)率隨年齡的降低和冷凍卵母細(xì)胞數(shù)量的增加而增加[11],每個(gè)冷凍卵母細(xì)胞的妊娠率為4.5% ~12%[12],獲得1 個(gè)活產(chǎn)需要至少10 枚卵母細(xì)胞[13],因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為需生育力保存而行卵母細(xì)胞冷凍的女性年齡應(yīng)≤35 歲、每次至少冷凍保存卵母細(xì)胞8 ~10 枚[4,14]。本研究對(duì)113 例不孕患者實(shí)施卵母細(xì)胞冷凍,每周期主動(dòng)冷凍者冷凍6 ~20 枚,被動(dòng)冷凍者冷凍所有卵母細(xì)胞(5 ~30 枚),根據(jù)患者冷凍卵母細(xì)胞數(shù)每周期解凍5 ~20 枚,平均10 ~12 枚,活產(chǎn)率為33.70%,與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(40.09%,P>0.05)。
卵母細(xì)胞由于體積較大,細(xì)胞內(nèi)水分較多、膜的滲透性較低,冷凍保護(hù)劑和水分無(wú)法快速有效進(jìn)出細(xì)胞;此外,卵母細(xì)胞具有獨(dú)特的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),其染色體直接暴露于細(xì)胞質(zhì)中無(wú)核膜的保護(hù),在冷凍和復(fù)蘇過(guò)程中產(chǎn)生的滲透壓變化極易導(dǎo)致DNA 及微管損傷[15]。因此,與胚胎冷凍相比卵母細(xì)胞冷凍的復(fù)蘇率更低,受精率及臨床結(jié)局更差[3]。玻璃化冷凍技術(shù)可使細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外環(huán)境迅速固化成玻璃狀態(tài),不會(huì)形成冰晶導(dǎo)致細(xì)胞及核損傷,可獲得較慢速冷凍更高的復(fù)蘇率、受精率及胚胎種植率[16-17];此外,采用ICSI 作為玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的受精方法可以有效解決因冷凍導(dǎo)致的透明帶硬化和受精障礙問(wèn)題,極大改善了卵母細(xì)胞凍融的臨床結(jié)局[2-3]。本研究采用玻璃化冷凍技術(shù)共凍存卵母細(xì)胞1 268 枚,凍融卵母細(xì)胞復(fù)蘇存活率為85.73%,與近期的報(bào)道相近(84%)[9,18-19]。同時(shí),本研究的結(jié)果顯示,凍卵組的可移植胚胎率、種植率、妊娠率、活產(chǎn)率與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異,表明卵母細(xì)胞凍融并不影響其發(fā)育潛能,可獲得與新鮮卵母細(xì)胞相近的臨床結(jié)局[9,20-21]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[22],冷凍和復(fù)蘇過(guò)程可導(dǎo)致卵母細(xì)胞DNA 斷裂、紡錘體和細(xì)胞器損傷及卵子老化。本研究中凍卵組的卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著低于對(duì)照組,無(wú)可移植胚胎周期率顯著高于對(duì)照組,提示玻璃化冷凍和復(fù)蘇過(guò)程仍可能對(duì)卵母細(xì)胞造成一定的損傷。
卵母細(xì)胞凍融及臨床應(yīng)用的安全性是不可忽視的問(wèn)題。研究表明,玻璃化冷凍卵母細(xì)胞出生的1 027 名兒童與使用新鮮卵母細(xì)胞出生的1 224 名兒童相比,其產(chǎn)科結(jié)局(糖尿病、高血壓、早產(chǎn))、分娩時(shí)孕周、出生體重、出生缺陷率、Apgar 評(píng)分及圍產(chǎn)期死亡率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[23]。進(jìn)一步研究表明,凍融卵母細(xì)胞胚胎的非整倍體率與新鮮卵母細(xì)胞來(lái)源胚胎的非整倍體率相似[24]。本研究的結(jié)果顯示,凍卵組的流產(chǎn)率、異位妊娠率及活產(chǎn)率與對(duì)照組間均無(wú)顯著性差異;共31 例分娩患者中,平均分娩孕周、平均新生兒出生體重及出生缺陷率均與對(duì)照組間無(wú)顯著性差異。但尚缺乏對(duì)凍融卵母細(xì)胞出生子代長(zhǎng)期隨訪的數(shù)據(jù),其遠(yuǎn)期安全性仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。
綜上所述,筆者所在中心的研究結(jié)果表明,卵母細(xì)胞冷凍可獲得與新鮮卵母細(xì)胞相近的臨床結(jié)局,可作為取卵日各種原因?qū)е氯【〉腁RT補(bǔ)救措施。同時(shí)對(duì)IVF 過(guò)程中部分年輕且獲卵數(shù)較多的患者凍存部分卵母細(xì)胞,不僅可為患者本人提供生育保險(xiǎn),而且可為有贈(zèng)卵需求的不孕患者提供較高質(zhì)量的卵源?;诒狙芯繕颖玖枯^少、且為回顧性分析,卵母細(xì)胞玻璃化冷凍技術(shù)的安全性、可行性及臨床價(jià)值仍需大樣本、多中心RCT 研究進(jìn)一步證實(shí)。