馬金蘭 王青 牛浩宇

1青海大學(xué)附屬醫(yī)院眼科（西寧810001）；2青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院眼科（西寧810001）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致成年人失明的主要原因［1］。目前，DR 的發(fā)病機制尚未明確，且缺乏有效的治療藥物，一般認為持續(xù)的高血糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷是其發(fā)生的基礎(chǔ)［2］。延齡草苷是延齡草的主要活性成分之一，具有抗炎、抗癌等功效［3-4］。研究［5］顯示，延齡草苷可通過調(diào)控Sirtl/NFκB 信號通路提高過氧化氫誘導(dǎo)的PC12 細胞抗氧化能力，并降低細胞炎性因子表達，保護PC12 細胞損傷。但目前，延齡草苷是否影響高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷尚未明確。

微小RNA（miRNA）是一類小分子非編碼RNA，在細胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及凋亡中發(fā)揮重要作用［6-8］。研究［9］顯示，過表達miR-1247-3p 可減少氧-糖剝奪/復(fù)氧處理的神經(jīng)細胞凋亡，減輕缺血再灌注腦損傷。但目前，miR-1247-3p 對高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷的影響也還未知。本研究以人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞（HRVEC）為研究對象，主要觀察了延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的HRVEC 細胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響及其能否調(diào)控miR-1247-3p 表達發(fā)揮作用，以期為DR 的治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞（HRVEC），上海雅吉生物科技有限公司；延齡草苷，純度≥98%，上海鈺博生物科技有限公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青；DMEM 培養(yǎng)基，北京索萊寶；Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒，大連寶生物；和LipofectamineTM2000 試劑盒，美國Invitrogen 公司；PCR 引物、miR-1247-3p 模擬物（mimcs）、模擬對照序列（miR-NC）、miR-1247-3p 抑制劑（anti-miR-1247-3p）、抑制劑陰性序列（antimiR-NC），上海生工，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和活性氧（ROS）試劑盒，南京建成；二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒和Annexin VFITC/PI 凋亡試劑盒；上海碧云天；兔抗人B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、B 淋巴細胞瘤-2 相關(guān)蛋白（Bax）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體，美國Santa Cruz 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含10 % FBS 的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HRVEC。將HRVEC 接種于6 孔板中（1 × 105個/孔），用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染miR-1247-3p mimcs、miR-NC 組、anti-miR-1247-3p、anti-miR-NC。轉(zhuǎn)染6 h 后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 分組處理未轉(zhuǎn)染的HRVEC 細胞及轉(zhuǎn)染后的細胞接種于24 孔板中（2.5×104個/孔）。未轉(zhuǎn)染的HRVEC 細胞分為對照組（細胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)）、高糖組（細胞用含30 mmol/L［10］葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)）、高糖+延齡草苷低劑量組（5 μmol/L［5］延齡草苷與30 mmol/L 葡萄糖共同培養(yǎng)）、高糖+延齡草苷中劑量組（10 μmol/L 延齡草苷與30 mmol/L 葡萄糖共同培養(yǎng)）和高糖+延齡草苷高劑量組（20 μmol/L延齡草苷與30 mmol/L葡萄糖共同培養(yǎng)）。轉(zhuǎn)染miR-1247-3p mimcs、miR-NC 的細胞用含30 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為高糖+miR-1247-3p、高糖+miR-NC。轉(zhuǎn)染anti-miR-1247-3p、anti-miR-NC 的細胞用含20 μmol/L 延齡草苷與30 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。每組設(shè)3 個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后，檢測以下指標。實驗重復(fù)3 次。

1.2.3 DCFH-DA 法檢測ROS細胞培養(yǎng)后，棄培養(yǎng)基，加入2 mL終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA工作液，孵育40 min，收集細胞，流式細胞儀檢測熒光強度，其中激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長520 nm。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測MDA 和SOD細胞培養(yǎng)后，收集細胞，加裂解液裂解，3 500 r/min 離心10 min，上清液-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別利用MDA 和SOD試劑盒，檢測上清液中MDA含量和SOD活力。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡細胞培養(yǎng)后，收集細胞，PBS 清洗2 次，利用Annexin V-FITC/PI試劑盒，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-1247-3p 表達Trizol 試劑提取細胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR 擴增。擴增程序：95 ℃10 min，95 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個循環(huán)。引物序列：miR-1247-3p 上游5'-CAGTGC ATAGCCACGTAACG-3'，下游5'-GCCGTAACCACTAATCCG-3'；內(nèi)參U6 上游5'-CTGAACAGGTCCCTAAGCTAC-3'，下游5'-CGTAATCCGTGACTGCTCG-3'。2-△△Ct法計算miR-1247-3p 相對U6 的表達量。

1.2.7 Western blot 法檢測Bax 和Bcl-2 蛋白表達RIPA 試劑提取細胞中總蛋白，經(jīng)BCA 法定量、SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，分別于Bax 和Bcl-2 一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。再于山羊抗兔孵育液中，37 ℃孵育1 h。加化學(xué)發(fā)光試劑避光顯影，曝光拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法GraphPad Prism 7.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的HRVEC 氧化應(yīng)激的影響與對照組比較，高糖組ROS 和MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）。與高糖組比較，高糖+延齡草苷不同劑量組ROS 和MDA水平降低（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05），且不同劑量組間各檢測指標兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的HRVEC 氧化應(yīng)激的影響Tab.1 The effect of trillin on oxidative stress of HRVEC induced by high glucose±s

表1 延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的HRVEC 氧化應(yīng)激的影響Tab.1 The effect of trillin on oxidative stress of HRVEC induced by high glucose±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與高糖組比較，#P ＜0.05；與高糖+延齡草苷低劑量組比較，&P ＜0.05；與高糖+延齡草苷中劑量組比較，$P ＜0.05

ROS 水平（%）SOD 活性（U/mg）MDA 含量（nmol/mg）100.00±7.52169.39±10.845.49±0.54 292.36±15.47*47.57±4.56*24.79±2.07*劑量組228.50±14.22#84.08±6.79#19.92±1.15#劑量組179.33±11.78#&113.65±8.87#&14.68±1.13#&分組對照組高糖組高糖+延齡草苷低高糖+延齡草苷中高糖+延齡草苷高劑量組F 值P 值128.39±11.30#&$351.355＜0.001 143.32±9.19#&$298.045＜0.001 8.33±0.79#&$366.982＜0.001

2.2 延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的HRVEC 凋亡的影響與對照組比較，高糖組細胞凋亡率和Bax 蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）。與高糖組比較，高糖+延齡草苷不同劑量組細胞凋亡率和Bax 蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平升高（P＜0.05），且不同劑量組間各檢測指標兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的HRVEC 凋亡的影響Tab.2 The effect of trillin on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose±s

表2 延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的HRVEC 凋亡的影響Tab.2 The effect of trillin on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與高糖組比較，#P ＜0.05；與高糖+延齡草苷低劑量組比較，&P ＜0.05；與高糖+延齡草苷中劑量組比較，$P ＜0.05

分組對照組高糖組高糖+延齡草苷低劑量組高糖+延齡草苷中劑量組高糖+延齡草苷高劑量組F 值P 值凋亡率（%）8.04±0.77 34.23±3.01*25.98±2.22#17.49±1.72#&11.59±1.15#&$272.506＜0.001 Bcl-2 蛋白0.67±0.05 0.22±0.02*0.34±0.03#0.46±0.03#&0.58±0.05#&$203.625＜0.001 Bax 蛋白0.29±0.02 0.81±0.06*0.68±0.04#0.55±0.03#&0.38±0.03#&$274.682＜0.001

圖1 延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的HRVEC 凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響Fig.1 The effect of trillin on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose and the protein expression of Bcl-2 and Bax

2.3 延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的HRVEC中miR-1247-3p 表達的影響與對照組比較，高糖組miR-1247-3p 水平降低［（0.41 ± 0.04）vs.（1.00 ± 0.07），t=21.954，P＜0.05］。與高糖組比較，高糖+延齡草苷不同劑量組miR-1247-3p 水平升高［（0.57±0.04）、（0.69±0.05）、（0.87±0.05）vs.（0.41±0.04），t=8.485、13.119、21.552，均P＜0.05］，且不同劑量組間各檢測指標兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 miR-1247-3p 過表達對高糖誘導(dǎo)的HRVEC氧化應(yīng)激的影響與高糖+miR-NC 組比較，高糖+miR-1247-3p 組ROS 和MDA 水平降低［（146.74 ±13.65）vs.（297.29±19.17）、（12.15±0.89）vs.（26.78±2.71），t= 19.192、15.387，均P＜0.05］，miR-1247-3p 水平和SOD 活性升高［（2.50 ± 0.21）vs.（1.00 ±0.04）、（124.56±9.55）vs.（45.91±4.17），t=21.050、22.642，均P＜0.05］。

2.5 miR-1247-3p 過表達對高糖誘導(dǎo)的HRVEC凋亡的影響與高糖+miR-NC 組比較，高糖+miR-1247-3p 組細胞凋亡率和Bax 蛋白水平降低［（14.80± 1.15）vs.（36.83 ± 3.02）、（0.45 ± 0.03）vs.（0.84 ±0.06），t= 20.452、17.441，均P＜0.05］，Bcl-2 蛋白水平升高［（0.54±0.03）vs.（0.21±0.02），t=27.458，P＜0.05］。見圖2。

圖2 miR-1247-3p 過表達對高糖誘導(dǎo)的HRVEC 凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響Fig.2 The effect of overexpressing miR-1247-3p on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose and the protein expression of Bcl-2 and Bax

2.6 抑制miR-1247-3p 表達逆轉(zhuǎn)延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的HRVEC 損傷的影響與高糖+延齡草苷+anti-miR-NC 組比較，與高糖+延齡草苷+anti-miR-1247-3p 組miR-1247-3p 水平降低［（0.38±0.04）vs.（1.00±0.05），t=29.048，P＜0.05］，ROS 和MDA 水平升高［（246.79±11.84）vs.（124.27±10.22）、（17.79± 1.70）vs.（8.13 ± 0.84），t= 23.500、15.283，均P＜0.05］，SOD 活性降低［（58.94 ± 5.73）vs.（144.37 ±14.29），t=16.647，P＜0.05］，凋亡率和Bax 蛋白水平升高［（27.34 ± 2.37）vs.（10.67 ± 1.13）、（0.71 ±0.05）vs.（0.36±0.03），t=19.047、18.007，P＜0.05］，Bcl-2蛋白水平降低［（0.28±0.02）vs.（0.59±0.05），t=17.270，P＜0.05］。見圖3。

圖3 抑制miR-1247-3p 逆轉(zhuǎn)延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的HRVEC 凋亡及Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響Fig.3 Inhibiting miR-1247-3p reversed the effect of trillin on the apoptosis of HRVEC induced by high glucose and the protein expression of Bcl-2 and Bax

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期特征為視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷，而持續(xù)的高血糖是誘導(dǎo)其發(fā)生的主要原因［11-12］。因此，采取有效的措施抑制或降低高血糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷對于糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療具有積極意義。作為延齡草的主要活性成分，延齡草苷發(fā)揮多種藥理功效。研究［13］顯示，延齡草苷可通過激活A(yù)MPK/Sirt1通路抑制肺組織中炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而降低腦缺血再灌注繼發(fā)肺損傷；延齡草苷可抑制脊髓組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕大鼠脊髓損傷［14］。但目前，延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷的影響和分子機制還未知。

糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制十分復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激導(dǎo)致的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞損傷是其機制之一［15］。正常生理條件下，機體內(nèi)的氧自由基處于動態(tài)平衡，而在病理狀態(tài)下，自由基的生成和清除平衡被打破，細胞內(nèi)的SOD 等抗氧化酶的活性降低，造成ROS 含量升高，引起細胞內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，加劇細胞損傷［16］。MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，可間接反映脂質(zhì)過氧化水平［18］。本研究顯示，高糖誘導(dǎo)HRVEC 細胞后，細胞中ROS和MDA 水平升高，而SOD 活力降低，與相關(guān)報道結(jié)果一致［19］，表明高糖誘導(dǎo)HRVEC 細胞產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)；而延齡草苷可降低高糖誘導(dǎo)的HRVEC 細胞中ROS 和MDA 水平，并提高SOD 活力，說明其可抑制高糖誘導(dǎo)的HRVEC 細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

氧化應(yīng)激可進一步誘導(dǎo)細胞凋亡。Bax和Bcl-2是細胞凋亡的重要調(diào)控分子，Bax 表達升高促進細胞凋亡，而Bcl-2 表達升高則抑制細胞凋亡［20-21］。本研究顯示，高糖可能通過調(diào)控Bax/Bcl-2 促進HRVEC 細胞，與相關(guān)報道結(jié)果一致［22］；不同劑量的延齡草苷干預(yù)后，高糖誘導(dǎo)的HRVEC 細胞凋亡及Bax 蛋白表達降低，而Bcl-2 蛋白表達升高，表明延齡草苷可有效降低高糖誘導(dǎo)的HRVEC 細胞凋亡。

miRNA 廣泛存在于真核生物中，參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等生理或病理過程，與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［23-24］。研究顯示，過表達miR-1247-3p 可減輕缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細胞H9c2 損傷，為急性心肌梗塞的治療提供了分子靶點［25］。本研究結(jié)果顯示，高糖可抑制HRVEC 細胞中miR-1247-3p 的表達，而過表達miR-1247-3p 可降低高糖誘導(dǎo)的HRVEC 細胞氧化應(yīng)激和凋亡，提示miR-1247-3p 可作為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的分子靶點。本研究還顯示，延齡草苷可劑量依賴性促進高糖誘導(dǎo)的HRVEC 細胞中miR-1247-3p 表達，而抑制miR-1247-3p 表達則逆轉(zhuǎn)了延齡草苷對高糖誘導(dǎo)的HRVEC 細胞氧化應(yīng)激和凋亡的抑制作用，提示延齡草苷通過上調(diào)miR-1247-3p 表達來減輕高糖誘導(dǎo)的HRVEC 細胞損傷。

綜上所述，延齡草苷可有效抑制高糖誘導(dǎo)的HRVEC 細胞氧化應(yīng)激和凋亡，減輕細胞損傷，其可能通過上調(diào)細胞中miR-1247-3p 表達來發(fā)揮作用，具有研發(fā)為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變藥物的潛在價值。本研究接下來將進一步探究miR-1247-3p 靶基因及下游信號通路對高糖誘導(dǎo)的HRVEC細胞損傷的影響，并通過動物實驗進一步驗證延齡草苷對糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的影響和作用機制。