劉建偉， 徐世宗， 李 立， 李建輝， 裴存文， 陳寶剛， 李建華

(河北省承德市中心醫(yī)院， 河北 承德 067000)

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cellcarcinoma，ESCC)是中國和日本發(fā)病率較高的組織學(xué)亞型[1]。ESCC患者在發(fā)病早期臨床癥狀不典型，當(dāng)患者出現(xiàn)吞咽困難、飲水嗆咳等癥狀時多已發(fā)展至中晚期。目前，外科手術(shù)仍是治療ESCC的主要手段，對于早期患者，經(jīng)胸腹腔鏡切除可取得很好的療效，但是對于中晚期ESCC患者僅通過單純進(jìn)行外科手術(shù)治療效果欠佳，術(shù)后極易復(fù)發(fā)[2]。近年來，新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NAC)以縮小病灶面積，殺滅微轉(zhuǎn)移病灶、提高手術(shù)療效在各種惡性腫瘤中被廣泛應(yīng)用[3]。然而，腫瘤細(xì)胞對藥物不敏感或耐藥是化療失敗的主要原因。因此，尋找化療敏感及耐藥靶點，對選擇化療方案，改善預(yù)后尤為關(guān)鍵。核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(nucleotide excision repair crosscomplementary gene1,ERCC1)為化療耐藥基因[4]。SLC7A11過表達(dá)通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)GSH合成從而干擾氧化應(yīng)激，參于多種癌癥化療耐藥性[5]。本文通過檢測ESCC組織ERCC1和SLC7A11，分析其與患者臨床病理特征及新輔助化療療效的關(guān)系，旨在明確療效和預(yù)后評估指標(biāo)，指導(dǎo)臨床治療。

1 資料與方法

1.1臨床資料收集承德市中心醫(yī)院心胸外科和腫瘤科2012年8月至2017年11月食管鱗癌新輔助化療及手術(shù)切除前病理標(biāo)本92例。36例食管正常黏膜組織(來源于食管良性病變胃鏡活檢組織，均已經(jīng)簽署知情同意書)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①治療前患者均經(jīng)食管鏡、CT、MRI及病理確診為食管鱗狀細(xì)胞癌，均為原發(fā)性食管鱗癌；②初次治療；③卡氏功能狀態(tài)評分≥80分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并嚴(yán)重心肺功能障礙、免疫系統(tǒng)疾病、凝血功能障礙等化療禁忌證；③無法接受隨訪。患者均簽署書面知情同意書，經(jīng)承德市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。食管鱗癌組92例，男64例，女28例；年齡為36～77歲，平均年齡(56.81±7.28)歲；臨床分期：ⅠA 期11例,ⅠB期13例,ⅡA期21例，ⅡB期18例，ⅢA期29例。其中ⅠA期11例為早期ESCC，僅接受胸腹腔鏡手術(shù)，未進(jìn)行新輔助化療。其余81例患者以對新輔助化療敏感為敏感組共59例，耐藥組共22例，兩組患者的性別、年齡、臨床分期等比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)，具有可比性。

1.2新輔助化療方法:新輔助化療前所有患者均行常規(guī)體格、血常規(guī)以及生化常規(guī)等檢查，無化療禁忌證。81例患者均采用以順鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶(PF方案)。順鉑60mg,每日兩次，d1～5；5-氟尿嘧啶750mg,每日兩次，d1～5；21d為1個化療周期，連續(xù)接受2個周期化療，化療結(jié)束2周后進(jìn)行手術(shù)治療。常規(guī)給予保護(hù)肝、護(hù)胃、止吐等對癥支持治療。

1.3食管鱗癌根治術(shù):81例患者接受食管鱗癌根治術(shù)：根據(jù)腫瘤不同的部位采取切口，手術(shù)安全界緣均大于腫瘤上下邊緣5cm，并切除腫瘤周圍纖維組織及淋巴結(jié)。

1.4免疫組織化學(xué)檢測ERCC1和SLC7A11蛋白的表達(dá):標(biāo)本均來自食管鱗癌及對照組患者石蠟包埋的組織，切成4μm厚的組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)后，將切片室溫冷卻，10%山羊血清封閉，加單克隆抗ERCC1或多克隆抗體SLC7A11在4℃下孵育過夜，二抗孵育。DAB免疫染色，封片。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)代替一抗，為陰性對照。多克隆抗體SLC7A11購自Abcam Biotechnology(1：500，Abcam公司，英國)，單克隆抗體ERCC1和免疫組化試劑盒購自中山金橋生物技術(shù)有限公司(中國北京市)。結(jié)果判斷由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)生采用雙盲法進(jìn)行。ERCC1陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，SLC7A11陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿。免疫組化染色密度：低倍顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野，分別在高倍鏡下計數(shù)，每個視野100個癌細(xì)胞中陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)：76%為3分，取5個視野的平均數(shù)作為判定結(jié)果。染色強(qiáng)度：未見染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，深黃色為3分，棕黑色為4分。陽性表達(dá)綜合細(xì)胞陽性密度與染色強(qiáng)度得分相加作為最終判定結(jié)果：<3分，為陰性；3～5分為陽性；>6分為強(qiáng)陽性。

1.5隨訪92例患者建立隨訪檔案，每3個月進(jìn)行電話或門診隨訪，對局部復(fù)發(fā)、死亡等情況進(jìn)行登記，隨訪36～60個月。觀察患者3年的復(fù)發(fā)率及病死率。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料率(%)表示，比較采用χ2檢驗。Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05，為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1食管鱗癌組織中ERCC1和SLC7A11的表達(dá)水平:ERCC1陽性表達(dá)主要位于食管鱗癌細(xì)胞核，SLC7A11陽性表達(dá)主要位于食管鱗癌細(xì)胞膜及細(xì)胞漿(圖1)。食管鱗癌組ERCC1陽性表達(dá)58例(63.0%)，食管正常黏膜組ERCC1陽性表達(dá)11例(30.5%)；食管鱗癌組SLC7A11陽性表達(dá)47例(51.1%);食管正常黏膜組SLC7A11陽性表達(dá)9例(25.0%)。兩組ERCC1、SLC7A11陽性表達(dá)率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2分別為10.991、7.155，P均<0.01)，見圖1。

圖1 食管組織ERCC1和SLC7A1表達(dá)(×200)

2.2ERCC1及SLC7A11表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系:食管鱗癌組與食管正常黏膜組ERCC1表達(dá)陽性率差異顯著(χ2=10.991，P<0.01)；食管鱗癌組中年齡、性別不同ERCC1表達(dá)陽性率差異無顯著性(P>0.05)；食管鱗癌組中分期不同及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移ERCC1表達(dá)陽性率差異有顯著性(P<0.05)；分化程度不同食管鱗癌組間比較后發(fā)現(xiàn)高分化組與中分化組/或低分化組比較P=0.003/0.002,差異有統(tǒng)計學(xué)意義，中分化和低分化組間比較P=0.543，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。食管鱗癌組與食管正常黏膜組SLC7A11表達(dá)陽性率差異非常顯著(χ2=7.155，P<0.01);食管鱗癌組中年齡、性別不同SLC7A11表達(dá)陽性率差異無顯著性(P>0.05)；食管鱗癌組中分期不同及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移SLC7A11表達(dá)陽性率差異有顯著性(P<0.05)；分化程度不同食管鱗癌組中SLC7A11表達(dá)陽性率差異有顯著性(P>0.05)，組間比較后發(fā)現(xiàn)高分化組與中分化組/或低分化組比較P=0.006/0.001,差異有統(tǒng)計學(xué)意義，中分化和低分化組間比較P=0.268，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

表1 食管鱗癌組織ERCC1 SLC7A11陽性表達(dá)率與患者臨床病理特征的關(guān)系n(%)

2.3食管鱗癌組織中 ERCC1與SLC7A11表達(dá)的相關(guān)性:Pearson 相關(guān)分析顯示，ERCC1 表達(dá)水平與SLC7A11表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.357，P=0.001)，見表2。

表2 食管鱗癌組織中 ERCC1與SLC7A11表達(dá)的相關(guān)性

2.4食管鱗癌患者術(shù)后SLC7A11、ERCC1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系:92例食管鱗癌患者，隨訪36～60個月，其中術(shù)后3年復(fù)發(fā)21例,復(fù)發(fā)率為22.8%(21/92)。復(fù)發(fā)組中ERCC1陽性表達(dá)率為76.2%(16/21)，無復(fù)發(fā)組為59.1%(42/71)，二者差異有顯著性(P<0.05)。復(fù)發(fā)組中SLC7A11陽性表達(dá)率為66.6%(14/21)，無復(fù)發(fā)組為46.5%(33/71)，復(fù)發(fā)組SLC7A11陽性表達(dá)率高于無復(fù)發(fā)組(P<0.05)；術(shù)后3年死亡13例,死亡率為14.1%(13/92)。死亡者中ERCC1陽性表達(dá)率為92.3%(12/13)，無死亡者為58.2%(46/79)，死亡組ERCC1陽性表達(dá)率高于無死亡組，差異有顯著性(P<0.05)。死亡者中SLC7A11陽性表達(dá)率為53.8%(7/13)，無死亡者為50.6%(40/79)，二者差異無顯著性(P>0.05)；Kaplan-Meier分析顯示食管鱗癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)中ERCC1(+)/ SLC7A11(+)表達(dá)明顯高于ERCC1(+)/ SLC7A11(-)，ERCC1(-)/ SLC7A11(+)及ERCC1(-)/ SLC7A11(-)組，P<0.05，差異有顯著性。食管鱗癌患者術(shù)后生存ERCC1(+)/ SLC7A11(+)表達(dá)組明顯低于ERCC1(+)/ SLC7A11(-)、ERCC1(-)/ SLC7A11(+)及ERCC1(-)/ SLC7A11(-)各組，P<0.05，差異有顯著性，見圖2。

圖2 食管鱗癌患者無復(fù)發(fā)生存函數(shù)及總生存函數(shù)

2.5食管鱗癌接受新輔助化療ERCC1和SlC7A11表達(dá)情況:92例食管鱗癌患者，其中11例僅接受胸腹腔鏡手術(shù)未進(jìn)行新輔助化療，其余81例接受新輔助化療患者中，敏感組59例，ERCC1陽性表達(dá)率為55.9%(33/59)，耐藥組22例，ERCC1陽性表達(dá)率為90.9%(20/22)，二者差異顯著(P<0.05)；敏感者59例，SLC7A11陽性表達(dá)率為45.7%(27/59)，耐藥組22例，SLC7A11陽性表達(dá)率為72.7%(16/22)，二者差異顯著(P<0.05)，見表3。

表3 食管鱗癌接受新輔助化療患者ERCC1和SlC7A11表達(dá)情況(n)

3 討 論

新輔助化療因為其消滅腫瘤患者早期出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移病灶，縮小原發(fā)腫瘤，縮小手術(shù)范圍，期望保留器官及其部分功能等優(yōu)點被臨床醫(yī)師廣泛接受。Ando等將330例II期或III期(T4除外)的食管鱗癌患者隨機(jī)分組，組1為單獨接受手術(shù)，組2為手術(shù)前使用兩個療程的順鉑加5-氟尿嘧啶，組1的5年總生存率為43%，組2為55%(P<0.05)，認(rèn)為術(shù)前用順鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶化療可作為II/III期食管鱗癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[6]。

鉑類藥物是新輔助化療藥物之一，該藥物通過與DNA結(jié)合形成Pt-DNA加合物，其活性過高可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在DNA合成后期或細(xì)胞分裂期，降低其修復(fù)細(xì)胞損傷的能力，ERCC1在DNA修復(fù)通路中發(fā)揮重要作用，具有對損傷基因片段的識別和切除修復(fù)功能，其表達(dá)的高低能反映整個DNA核酸切除修復(fù)活性的水平，可能是ERCC1蛋白高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤患者對鉑類化療藥物產(chǎn)生了耐藥的主要機(jī)制[7,8]。Ozcan等證實在接受鉑類NAC的膀胱癌患者中，認(rèn)為高ERCC1表達(dá)可作為膀胱癌不良預(yù)后的指標(biāo)[9]。潘婷婷等免疫組織化學(xué)方法對126例胃癌患者第1次胃鏡取檢和新輔助化療后行R0切除術(shù)的胃癌組織中ERCC1的表達(dá)水平與NAC敏感性關(guān)系的研究顯示，NAC前后ERCC1表達(dá)均與療效相關(guān)(均P<0.05)，ERCC1的表達(dá)是胃癌患者NAC療效的獨立預(yù)測因子[10]。本研究中食管鱗癌組ERCC1高表達(dá)與對照組相比呈顯著差異(P<0.05)；81例食管鱗癌患者接受新輔助化療患者中，敏感組59例，ERCC1陽性表達(dá)率為55.9%(33/59)，耐藥組22例，ERCC1陽性表達(dá)率為90.9%(20/22)，兩組表達(dá)差異顯著(P<0.05)；表明ERCC1的高表達(dá)可預(yù)測食管鱗癌患者NAC的療效。

SLC7A11參與多種腫瘤的耐藥研究已經(jīng)廣泛進(jìn)行。卵巢癌(OC)患者由于耐藥而預(yù)后較差，Yin等應(yīng)用基于微陣列方法鑒定131個基因與OC耐藥性和預(yù)后的因素相關(guān)，發(fā)現(xiàn)90個基因與鉑耐藥性相關(guān)，其中SLC7A11是OS的獨立危險因素[11]。Horibe等通過逐步增加順鉑(CDDP)濃度至4和20μM，建立了人類肺癌A549細(xì)胞衍生的低級和高級CDDP耐藥亞系，稱為ACR4和ACR20細(xì)胞，ACR4和ACR20細(xì)胞對CDDP的抵抗力分別比A549細(xì)胞高6到16倍，通過特異性siRNA抑制SLC7A11 mRNA可顯著提高A549，ACR4和ACR20細(xì)胞對CDDP的敏感性，導(dǎo)致CDDP耐藥[12]。提示SLC7A11對化療藥物敏感和耐藥起到重要作用。本研究中食管鱗癌組SLC7A11蛋白高表達(dá)，與對照組相比呈顯著差異(P<0.05))；81例食管鱗癌患者接受新輔助化療患者中，敏感組59例，SLC7A11陽性表達(dá)率為45.7%(27/59)，耐藥組22例，SLC7A11陽性表達(dá)率為72.7%(16/22)，二者差異顯著(P<0.05)，表明SLC7A11的高表達(dá)可預(yù)測食管鱗癌患者NAC的療效較差。

目前國內(nèi)在ERCC1聯(lián)合SLC7A11表達(dá)能否對食管鱗癌患者新輔助化療療效影響和預(yù)測預(yù)后的文獻(xiàn)報道缺乏。本研究食管鱗癌組中ERCC1及SLC7A11蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)(P<0.01)。92例食管鱗癌患者，術(shù)后3年復(fù)發(fā)21例，Kaplan-Meier分析顯示術(shù)后復(fù)發(fā)中ERCC1(+)/ SLC7A11(+)表達(dá)明顯高于ERCC1(+)/ SLC7A11(-)，ERCC1(-)/ SLC7A11(+)及ERCC1(-)/ SLC7A11(-)組，P<0.05，差異有顯著性；術(shù)后3年死亡13例,死亡組中ERCC1(+)/ SLC7A11(+)表達(dá)明顯高于其余組， P<0.05，差異有顯著性。結(jié)果表明，ERCC1(+)/ SLC7A11(+)食管鱗癌患者對新輔助化療容易發(fā)生耐藥，且預(yù)后較差。

綜上所述本研究提示ERCC1(+)/SLC7A11(+)對食管鱗癌術(shù)后復(fù)發(fā)、生存及新輔助化療療效的判斷有重要意義。食管鱗癌威脅人們的健康安全，以此作為靶點在分子層面的深入研究有望提高食管鱗癌對新輔助化療敏感性提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，對提高食管鱗癌治療療效有重要意義。