夏恩蕊，張素妍，田格格，李 浩，杜玉銳，張順貞

（云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，疾病譜包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。隨著肥胖發(fā)病率的增加，NAFLD 已成為全球關(guān)注的主要健康問題之一。NLRP3 是一種模式識別受體（PRRs），隸屬于NOD 樣受體家族（NOD-like receptor，NLRs），是NLRP3 炎癥小體的組成部件之一[2]。在病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的刺激下，NLRP3 可出現(xiàn)上調(diào)，啟動(dòng)炎癥小體的組裝，介導(dǎo)大量IL-18、IL-1β 的釋放[3-5]。NAFLD 上調(diào)肝臟中NLRP3，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-18、IL-1β 的增加[6]，這一過程是單純脂肪肝進(jìn)展到NASH 及肝纖維化的關(guān)鍵因素之一[7]。本研究旨在探討NAFLD 模型大鼠小腸、肝臟中NLRP3 及相關(guān)炎癥因子表達(dá)情況。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 SD 雄性大鼠（180～220 g）20 只［購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016－0002，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號：SYXK（滇）K2013－0002］。

1.2 試劑 高脂飼料（82.5%普通飼料、10%豬油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%蛋黃粉）[8]。普通飼料由楚商生物有限公司提供。

ALT、AST、IL-18、IL-1β、脂多糖ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，MM-0047R）。TC、TG生化試劑盒（南京建成，20190824）。Ultrapure RNA Kit RNA 提取試劑盒（康為世紀(jì)，CW0581S）；HiFiScript cDNA Synthesis Kit（康為世紀(jì)，CW2569M）；UltraSYBR Mixture（康為世紀(jì)，CW0957M）。NLRP3 抗體（abcam，ab214185）、SP 免疫組化試劑盒（中杉金橋科技公司，2004C1009）、DAB 顯色試劑盒（中杉金橋科技公司，2024G0331）。

1.3 儀器 垂直板電泳裝置（TanonVE－180P RE）、垂直板電泳膠轉(zhuǎn)膜儀裝置（Tanon VE－586）、熒光定量PCR 儀（Heal Force，CG）、石蠟切片機(jī)（Thermo，F(xiàn)inesse 325）、顯微鏡（奧林巴斯，CX23）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及取材 將20 只SD 雄性大鼠隨機(jī)分為2 組，即正常組、高脂飲食組，每組各10 只。正常對照組給予普通飼料，高脂飲食組給予高脂飼料。4 周末每組取2 只驗(yàn)?zāi)＃? 周末處死動(dòng)物，收集血清、肝臟及小腸樣本。肝大葉置于4%多聚甲醛固定，室溫保存。其余肝臟和小腸分裝一份置于RNA保存液中，其余分裝后-80℃保存。血清樣本分裝后-80℃保存。

2.2 血清肝功能變化 血清4℃解凍，根據(jù)試劑盒說明書檢測大鼠血清ALT、AST、TC、TG 水平。

2.3 肝臟組織病理切片 取4%多聚甲醛固定的肝大葉，常規(guī)操作制備肝組織石蠟切片，HE 染色后顯微鏡下（10×40 倍）拍攝病理圖片。

2.4 ELISA 試劑盒檢測大鼠血清、肝臟炎性因子按試劑盒說明書操作，檢測血清、肝組織中的IL-18、IL-1β。

2.5 RT-PCR 法檢測大鼠肝臟、小腸組織中NLRP3mRNA 表達(dá)量 按試劑盒步驟提取RNA，測定濃度和純度。利用Primer3 軟件設(shè)計(jì)引物序列，由華大基因合成，以RT-PCR 方法檢測NLRP3mRNA 水平。

2.6 免疫組化法檢測大鼠肝臟、小腸組織中NLRP3蛋白表達(dá)水平 肝臟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù)、過氧化物酶結(jié)合、抗原封閉。NLRP3 一抗4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫30 min，PBS 沖洗，滴加二抗，37℃孵育20 min，PBS 沖洗。DAB 顯色5 min，PBS 沖洗，蘇木精復(fù)染5 min，鹽酸酒精分化1～3 s，自來水沖洗10 min，常規(guī)脫水，透明，封片，鏡檢。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS20.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果使用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行陽性率統(tǒng)計(jì)。

2.8 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由云南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（批號：R－06201947），符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

3 結(jié)果

3.1 肝組織病理學(xué)變化

3.1.1 肝臟形態(tài)觀察 正常組大鼠肝臟呈暗紅色，表面光滑，邊緣銳利，體積較小。模型組大鼠肝臟顏色明顯偏黃，表面有脂肪粒凸起，有油膩感，體積較大。如圖1。

圖1 肝臟形態(tài)

3.1.2 HE 染色 正常組大鼠肝組織肝索清晰，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，沿肝索有序排列，細(xì)胞核邊緣清晰，胞質(zhì)未見明顯脂肪空泡及炎性病變。高脂飲食組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，可見明顯的肝細(xì)胞氣球樣變，細(xì)胞大小不一，出現(xiàn)大量脂肪空泡，部分細(xì)胞核邊緣模糊或不可見。如圖2。

圖2 肝組織病理切片（HE 染色病理切片，×400）

3.1.3 油紅O 染色 正常組肝組織基本無橘紅色脂滴，細(xì)胞核清晰。模型組大鼠可見大量圓形脂肪空泡，以及大面積橘紅色脂滴，細(xì)胞核邊緣多不清晰，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，與正常組相比，出現(xiàn)明顯的脂肪變性。如圖3。

3.2 生化指標(biāo) 檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠血清肝功能指標(biāo)ALT、AST 顯著高于正常組（P＜0.05），提示模型組大鼠存在肝臟細(xì)胞受損情況。此外，模型組大鼠肝臟中TC、TG 顯著高于正常組（P＜0.05），血清中TG 顯著升高（P＜0.05），TC 有上升趨勢，但與正常組無顯著差異（P＞0.05）。如表1。

表1 大鼠生化指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組相比，▲P＜0.05。

ALT AST TC TG組別 n 血清/（mmol·L-1）正常組 8 15.78±1.93 15.72±1.32 47.08±4.32 47.29±2.6 0.58±0.20 0.67±0.18 7.82±2.49 1.11±0.26模型組 8 21.55±2.02▲ 21.99±1.09▲ 67.1±5.37▲ 69.8±4.27▲ 0.94±0.20▲ 0.91±0.13 10.35±1.93▲ 1.33±0.46▲F 值 0.19 0.25 0.67 1.21 0.80 0.51 0.24 1.24肝臟/（ng·L-1）血清/（ng·L-1）肝臟/（ng·L-1）血清/（ng·L-1）肝臟/（mmol·gprot-1）血清/（mmol·L-1）肝臟/（mmol·gprot-1）P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

3.2.1 肝臟、血液中炎癥因子 ELISA 試劑盒檢測結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組肝臟中IL-1β、IL-18顯著升高（P＜0.05），血清中IL-1β 顯著升高（P＜0.05）。如表2。

表2 大鼠炎癥因子表達(dá)量比較（±s，ng·L-1）

注：與正常組相比，▲P＜0.05。

組別 n IL-1β IL-18肝臟 血清 肝臟 血清正常組 8 37.77±1.82 45.28±9.65 164.23±35.55 106.72±16.64模型組 8 43.31±1.71▲ 65.2±17.19▲ 196.13±35.63 139.76±11.07▲F 值 0.116 1.556 0.218 1.437 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05

3.2.2 RT-PCR 檢測肝臟、小腸中NLRP3mRNA 表達(dá)量 RT-PCR 結(jié)果表明，模型組大鼠肝臟、小腸NLRP3mRNA 表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。如表3。

表3 大鼠NLRP3mRNA 表達(dá)量（±s）

表3 大鼠NLRP3mRNA 表達(dá)量（±s）

注：與正常組相比，▲P＜0.05。

組別 n NLRP3mRNA肝臟 小腸正常組 3 0.01±0.004 0.002±0.001模型組 3 0.031±0.001▲ 0.221±0.109▲F 值 4 15.659 P 值 ＜0.05 ＜0.05

3.2.3 免疫組化法檢測肝臟、小腸中NLRP3 表達(dá)量與正常組相比，模型組大鼠肝臟、小腸NLRP3 表達(dá)量顯著升高，且P＜0.05，如表4。從免疫組化圖片中可以看出，模型組大鼠較正常組大鼠的棕色區(qū)域更多，即NLRP3 陽性表達(dá)更高，如圖4。

圖4 NLRP3 表達(dá)量（免疫組化染色，×400）

表4 大鼠NLRP3 陽性率（±s）

表4 大鼠NLRP3 陽性率（±s）

注：與正常組相比，▲P＜0.05。

組別 n NLRP3 陽性率/%肝臟 小腸正常組 3 0.0065±0.004 0.0037±0.005模型組 3 0.0402±0.0133▲ 0.0349±0.0121▲F 值 3.284 7.454 P 值 ＜0.05 ＜0.05

4 討論

孫林林等[8]對高脂模型進(jìn)行改良，添加膽酸鈉及蛋黃粉增加肝臟對膽固醇的吸收，加快了成模速度，該改良模型8 周出現(xiàn)炎性反應(yīng)，12 周則形成明顯的肝臟纖維化。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)該模型成模較快，比普通高脂模型有更好的炎性反應(yīng)。

“腸-肝軸”在1988 年由Marshall 提出[9]，其認(rèn)為腸道與肝臟由于門靜脈的連接和相同的胚胎起源，二者在生理病理方面相互影響[10]。肝腸之間可通過門靜脈進(jìn)行物質(zhì)交換，而腸道菌群及其它物理化學(xué)因素的改變，可能造成腸道屏障損傷，腸內(nèi)有害物質(zhì)（如LPS）進(jìn)入門靜脈，激活小腸和肝臟固有免疫，上調(diào)炎癥因子，進(jìn)一步加重了肝內(nèi)炎癥和代謝紊亂[11]。課題組對NAFLD 肝、腸NLRP3 和相關(guān)炎癥因子變化進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)NAFLD 大鼠中小腸、肝臟中NLRP3 表達(dá)顯著升高，肝臟、血清中炎癥因子IL-1β、IL-18 顯著上升。NAFLD 不僅能夠激活腸道的固有免疫，且能通過門靜脈引起肝臟免疫反應(yīng)的激活，并進(jìn)一步增加炎癥因子的釋放。

有研究認(rèn)為高脂飲食改變腸道菌群，誘發(fā)腸道炎癥，腸道屏障功能減弱后，LPS 可從腸道入血，并經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟，激活Toll 樣受體4（TLR4），使肝NLRP3 炎癥小體活化，隨后IL-18、IL-1β 釋放增加，肝臟炎癥反應(yīng)加劇[12-14]。

NLRP3 炎癥小體的激活途徑多樣，微生物、膽汁酸等其它因素是否參與NAFLD 模型大鼠小腸、肝臟內(nèi)NLRP3 的調(diào)節(jié)尚待進(jìn)一步研究。