徐銳煌，林 麗△，萬(wàn)春平，卜文超，李 寧，何 丹

（1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2. 云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythmatosus，SLE）是以致病性自身抗體和免疫復(fù)合物形成并介導(dǎo)器官、組織損傷的自身免疫病。狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是SLE 的腎臟損害，臨床約有50%以上的SLE 患者有腎損害表現(xiàn)，但腎活檢則顯示幾乎100%的腎臟均受累，約有20%的LN 患者5 年內(nèi)可發(fā)展為終末期腎病，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一[1]。本研究通過(guò)觀察中藥復(fù)方滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 狼瘡小鼠24 h 尿蛋白含量影響，以及該方對(duì)狼瘡小鼠腎臟病理變化、免疫復(fù)合物沉積和腎組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）含量的影響，從組織學(xué)、分子生物學(xué)水平探究該方的腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 MRL/lpr 狼瘡小鼠，7～8 周齡，體質(zhì)量20～22 g，雌性，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：scxk（京）2019-0010。動(dòng)物經(jīng)消毒滅菌后，飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物房，溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h 光暗循環(huán)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性養(yǎng)殖1 周后使用。飼料和水均經(jīng)過(guò)高溫消毒殺菌處理，動(dòng)物自由啃食。所有實(shí)驗(yàn)操作均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)條例嚴(yán)格進(jìn)行。

1.2 藥物及試劑 滋陰清熱活血方由生地、知母、丹參、川芎、墨旱蓮、黃柏等組成，中藥飲片常規(guī)浸泡煎煮，過(guò)濾去雜質(zhì)后，將藥液裝入旋蒸儀進(jìn)行蒸餾水分處理，制成浸膏（1 g 浸膏相當(dāng)于2.8 g 生藥），置于冰箱4 ℃冷藏備用。醋酸潑尼松片購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)201056。尿蛋白測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所（C035-2-1）；VEGF 抗體（一抗）ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢艾博生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠IgGH&L（HRP）購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 主要儀器 BRE05 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自佛山予華儀器科技有限公司；離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Thermo Scientific Hearers；LEICA RM2235 切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)萊卡儀器有限公司；BM-IX 生物組織包埋機(jī)、CS-IV 型攤片烤片機(jī)、RS-18 生物組織全自動(dòng)染色機(jī)購(gòu)自湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司；Epoch 連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek 公司；自動(dòng)熒光免疫分析儀購(gòu)自上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥 MRL/lpr 小鼠適應(yīng)性養(yǎng)殖11周后，根據(jù)尿蛋白濃度，平均分為5 組，即模型組、激素（醋酸潑尼松）組、中藥（滋陰清熱活血方）組、中藥加激素全量組、中藥加激素半量組，每組10 只。其中，激素組、中藥組分別給予醋酸潑尼松6 mg/kg 和滋陰清熱活血方37.5 g/kg；中藥加激素全量組和中藥加激素半量組分別在給予醋酸潑尼松6 mg/kg、3 mg/kg 基礎(chǔ)上，予滋陰清熱活血方37.5 g/kg 灌胃；模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。每日1 次，連續(xù)灌胃4 周。小鼠給藥劑量依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量的換算公式計(jì)算得出。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.2.1 24 h 尿蛋白含量測(cè)定 分別于實(shí)驗(yàn)前（0 周）、給藥第2 周、第4 周用代謝籠收集實(shí)驗(yàn)小鼠24 h 尿液，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)尿蛋白濃度，實(shí)驗(yàn)方法及相關(guān)操作嚴(yán)格參照產(chǎn)品說(shuō)明書。

2.2.2 HE 染色檢測(cè)腎臟病理 MRL/lpr 小鼠給藥4周后，摘眼球取血、脫臼處死小鼠。取出兩側(cè)腎臟，均經(jīng)腎門及上下極將腎臟縱行剖開(kāi)，同側(cè)腎臟剖開(kāi)的一半腎組織迅速放入液氮后-80 ℃凍存，另一半腎組織用10%甲醛固定，常規(guī)切片HE 染色。

2.2.3 免疫熒光觀察腎組織IgG 表達(dá) 將取出腎臟，OCT 包埋，于冰凍切片機(jī)切片，丙酮固定15 min，BSA 封閉，PBST 置于搖床上洗5 次后，滴加Goat anti mouse lgG 抗體，室溫避光1 h，封片，熒光拍照。

2.2.4 免疫組化檢測(cè)腎組織VEGF 含量 藥物干預(yù)結(jié)束后，取腎組織固定，常規(guī)脫水、切片和脫蠟，免疫組化SABC（鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物）法染色，顯微鏡觀察。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理。數(shù)據(jù)處理用（±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件包，多組間數(shù)據(jù)的差異顯著性用方差分析和最小顯著法（LSD 法）進(jìn)行兩兩比較檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 為差異非常顯著。

3 結(jié)果

3.1 MRL/lpr 小鼠24 h 尿蛋白含量變化情況 結(jié)果如表1 和圖1 所示，實(shí)驗(yàn)前各給藥組蛋白尿水平無(wú)明顯差異。隨著給藥時(shí)間的遞增，除模型組外，其余4 組的尿蛋白含量逐漸下降。給藥第2 周時(shí)，與模型組比較，中藥加激素全量組尿蛋白含量明顯下降，差異非常顯著（P＜0.01）；其次為中藥組、激素組和中藥加激素半量組，差異有顯著性意義（P＜0.05）；中藥組與激素組之間效果相當(dāng)，無(wú)可比性。給藥第4 周時(shí)，與模型組比較，中藥加激素全量組、激素組和中藥加激素半量組的尿蛋白含量顯著下降，差異性非常顯著（P＜0.01），3 組之間比較，中藥加激素全量組尿蛋白含量下降尤為明顯；中藥組尿蛋白含量呈緩慢下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠24 h 尿蛋白（μg）含量變化情況

表1 各組小鼠24 h 尿蛋白（μg）含量變化情況（±s，n=10）

表1 各組小鼠24 h 尿蛋白（μg）含量變化情況（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.01。

組別 給藥劑量/（g·kg-1）尿蛋白/（μg·mL-1）0 周 2 周 4 周模型組 - 2 196.18±322.49 2 043.99±326.42 1 481.73±131.84激素組 0.006 2 134.09±944.96 1 269.67±149.13* 740.86±152.74***中藥組 37.5 2 139.99±966.46 1 178.93±412.73* 1 051.11±299.8*中藥加激素全量組 37.5+0.006 2 113.68±194.49 1 008.98±250.53*** 645.4±255.95***中藥加激素半量組 37.5+0.003 2 181.26±830.48 1711.74±187.3 755.39±304.81***

3.2 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 小鼠腎臟病理?yè)p傷的影響 結(jié)果如圖2 所示，模型組腎小球萎縮或增生，大小不均勻，形態(tài)多不正常，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性或壞死，部分腎小管為透明管型，間質(zhì)水腫擴(kuò)張明顯，可見(jiàn)大量出血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。與模型組比較，激素組腎小球大小不一，部分腎小球充血擴(kuò)張，有少量腎小管為透明管型，間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；中藥組腎皮質(zhì)有少量腎小球萎縮，間質(zhì)有少量血管輕微充血擴(kuò)張，腎臟病理較激素組輕；中藥加激素全量組腎小球結(jié)構(gòu)比較完整，未見(jiàn)明顯炎癥、水腫，偶見(jiàn)輕微出血；中藥加激素半量組腎小球萎縮，腎小球內(nèi)可見(jiàn)少量玻璃樣變性，腎間質(zhì)內(nèi)有少量血管充血，病理情況略優(yōu)于中藥組，但無(wú)中藥加激素全量組好。

圖2 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 小鼠腎臟病理?yè)p傷的影響（HE，×200）

3.3 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 小鼠腎臟IgG 沉積的影響 結(jié)果如表2 和圖3、圖4 所示，模型組大部分腎小球毛細(xì)血管襻上可見(jiàn)大量IgG 呈片狀沉積，沉積范圍累及整個(gè)腎小球，且熒光強(qiáng)度高，可見(jiàn)熒光染色強(qiáng)陽(yáng)性腎小球；各治療組腎臟IgG 沉積明顯減少，熒光強(qiáng)度明顯減弱，熒光面積明顯縮小，可見(jiàn)部分熒光染色陽(yáng)性腎小球。與模型組比較，中藥加激素全量組腎臟的IgG 熒光面積、熒光強(qiáng)度明顯縮小、減弱（P＜0.01），其次為中藥加激素半量組和中藥組腎臟的IgG熒光面積、熒光強(qiáng)度較明顯縮小、減弱（P＜0.05），激素組腎臟的IgG 熒光面積、熒光強(qiáng)度略有縮小、減弱。與激素組比較，中藥組、中藥加激素全量組和中藥加激素半量組腎臟的IgG 熒光面積、熒光強(qiáng)度均有明顯差別。

圖3 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 小鼠腎臟IgG 沉積的影響

圖4 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 小鼠腎臟IgG 沉積的影響（FITC 染色，×400）

表2 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 小鼠腎臟IgG 沉積的影響（±s，n=10）

表2 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 小鼠腎臟IgG 沉積的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，P＞0.05、*P＜0.05、***P＜0.01。

組別 給藥劑量/（g·kg-1） 熒光面積 熒光強(qiáng)度模型組 - 249 960±15 387 81.11±13.65激素組 0.006 219 928±7 677.25* 64.32±5.8*中藥組 37.5 200 870±20 630.21* 54.09±3.88*中藥加激素半量組 37.5+0.003 136 580.67±28 259.79* 31.52±0.54*中藥加激素全量組 37.5+0.006 54 379±4 990.91*** 23.18±1.7***?

3.4 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 小鼠腎組織VEGF含量的影響 根據(jù)光鏡下判定結(jié)果（腎組織內(nèi)棕黃色顆粒沉積為陽(yáng)性結(jié)果），采用Image-ProP6.0 圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，用區(qū)域內(nèi)陽(yáng)性部分的積分光密度（IOD）與區(qū)域總面積（are）的比值計(jì)算，VEGF 在腎組織中的相對(duì)含量即平均光密度AOD=1OD/are。結(jié)果如表3 和圖5、圖6 顯示，與模型組比較，各治療組中小鼠腎組織VEGF 含量均有不同程度的減少，其中，中藥加激素全量組小鼠腎組織VEGF 含量減少尤為明顯（P＜0.01），其次為中藥加激素半量組、中藥組、激素組（P＜0.05）。與激素組比較，中藥組腎組織VEGF含量減少較明顯。

圖5 各組平均光密度比較

圖6 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 小鼠腎組織VEGF 含量的影響

表3 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 小鼠腎組織VEGF 含量的影響（±s，n=10）

表3 滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 小鼠腎組織VEGF 含量的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，P＞0.05、*P＜0.05、***P＜0.01。

IOD 平均值（IOD/Area）模型組 - 0.067 66±0.008 15激素組 0.006 0.041 69±0.004 32*中藥組 37.5 0.025 49±0.003 06*中藥加激素半量組 37.5+0.003 0.011 02±0.000 89*中藥加激素全量組 37.5+0.006 0.004 55±0.001 08***組別 給藥劑量/（g·kg-1）

4 討論

LN 是我國(guó)常見(jiàn)的繼發(fā)性腎臟疾病。一般認(rèn)為，免疫復(fù)合物形成與沉積是引起本病的主要機(jī)制，西醫(yī)治療以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主[1]。有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，LN 腎臟VEGF 的表達(dá)水平與其病理?yè)p害有關(guān)，損害越重，表達(dá)越多[2]。有研究認(rèn)為，VEGF 參與了LN的起病和發(fā)展，可作為監(jiān)測(cè)SLE 病情和活動(dòng)度的指標(biāo)；VEGF 參與了蛋白尿的形成及腎臟損害[3-4]。近年來(lái)的研究表明，VEGF 對(duì)腎組織具有一定的生理作用，同時(shí)也與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。

根據(jù)LN 的臨床特點(diǎn)，歸屬于中醫(yī)學(xué)“陰陽(yáng)毒”“水腫”“腎著”“腰痛”“虛勞”等病證范疇[6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病的發(fā)病內(nèi)因多為素體虛弱，外因多與感受邪毒有關(guān)，其中正虛以陰虛最為重要，邪毒以熱毒最為關(guān)鍵[7]。歷代多數(shù)醫(yī)家也認(rèn)為，LN 的發(fā)病病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜[8]。全國(guó)名中醫(yī)孟如教授認(rèn)為，陰陽(yáng)氣血虧虛、臟腑功能失調(diào)為本，熱毒熾盛為標(biāo)是本病的基本病機(jī)特點(diǎn)[9]。臨床基本證型有熱毒熾盛證、熱毒夾瘀證、肝腎陰虛證、陰虛陽(yáng)亢證、肝陽(yáng)上亢證、氣虛水泛證、脾腎陽(yáng)虛證、瘀水互結(jié)證等[10]，在LN 的慢性活動(dòng)期以肝腎陰虛證較為常見(jiàn)。

滋陰清熱活血方是林麗教授在繼承導(dǎo)師孟如教授臨床經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步化裁而來(lái)的自擬方，臨床用于LN 屬肝腎陰虛兼血瘀證[11]患者，并取得較好療效[12]。其認(rèn)為腎陰虧虛、熱瘀互結(jié)為L(zhǎng)N 的基本病機(jī)，滋陰補(bǔ)腎、清熱活血應(yīng)為本病的基本治法。因本病患者素有稟賦不足，腎陰虧虛，易感邪熱外襲，內(nèi)外合邪，腎陰進(jìn)一步耗損，生熱化火，致熱壅血瘀而病。方中生地黃滋養(yǎng)腎陰，女貞子滋補(bǔ)肝腎，二藥共為君；澤瀉利濕瀉腎濁，墨旱蓮滋補(bǔ)肝腎、涼血止血，川芎活血行氣，知母、黃柏清熱瀉火，諸藥共為臣；牡丹皮涼血活血，丹參、雞血藤活血祛瘀以助川芎活血之功，大薊涼血祛瘀以助牡丹皮之力，諸藥共為佐使。全方共奏滋陰補(bǔ)腎、清熱活血之功。從現(xiàn)代中藥藥理學(xué)角度看，生地黃能擴(kuò)張血管，減低毛細(xì)血管通透性，抑制血管內(nèi)皮炎癥，且能對(duì)抗激素對(duì)垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)的抑制作用，防止激素引起的腎上腺皮質(zhì)萎縮和皮質(zhì)酮水平下降，具有免疫抑制作用[12]；川芎能顯著增加腎血流量，抑制腎小球纖維化，減少尿蛋白排泄，防治急性腎功能衰竭等作用[12]；黃柏能抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)[12]；丹參能改善腎功能、保護(hù)缺血性腎損傷[13]，與川芎合用能協(xié)同發(fā)揮改善腎功能作用；牡丹皮有顯著抑制炎癥作用，能抑制血小板聚集，抗血栓作用，調(diào)節(jié)免疫功能[13]；澤瀉有利尿作用，能增加尿量，增加尿素與氯化物的排泄，對(duì)腎炎患者利尿作用更為明顯[13]。另有研究認(rèn)為，丹參可通過(guò)調(diào)節(jié)腎組織VEGF 含量阻止腎間質(zhì)纖維化[14]。

本研究結(jié)果顯示，給藥第2 周時(shí)，中藥組與激素組、中藥加激素半量組尿蛋白含量有明顯下降，差異有顯著性意義（P＜0.05），中藥加激素全量組尿蛋白含量下降顯著（P＜0.01）；給藥第4 周時(shí)，中藥組尿蛋白含量呈緩慢下降趨勢(shì)，差異有顯著性意義（P＜0.05），中藥加激素全量組、激素組和中藥加激素半量組尿蛋白含量下降顯著（P＜0.01）。說(shuō)明滋陰清熱活血方對(duì)MRL/lpr 狼瘡小鼠不同給藥階段的24 h 尿蛋白水平均有影響。HE 染色觀察到中藥組小鼠腎臟病理的改善優(yōu)于激素組，中藥加激素全量組小鼠腎臟病理改善尤為顯著；另外，免疫熒光檢測(cè)到中藥組和激素組小鼠的腎臟IgG 沉積均有明顯減少，差異有顯著性意義（P＜0.05），二組之間無(wú)可比性；中藥加激素全量組小鼠的腎臟IgG 沉積減少尤為顯著（P＜0.01）。說(shuō)明該方對(duì)狼瘡小鼠的腎臟有一定保護(hù)作用。免疫組化檢測(cè)到與激素組比較，中藥組小鼠腎組織VEGF 含量明顯減少，差異有顯著性意義（P＜0.05），中藥加激素全量組小鼠腎組織VEGF 含量減少最為明顯（P＜0.01），說(shuō)明該方對(duì)狼瘡小鼠腎組織VEGF 的表達(dá)有明顯影響。

綜上可認(rèn)為，滋陰清熱活血方具有降低狼瘡小鼠腎組織VEGF 的含量，減少尿蛋白含量，明顯改善腎臟病理?yè)p傷，減少腎臟免疫復(fù)合物的沉積，從而起到保護(hù)腎臟的作用；以上相關(guān)指標(biāo)的綜合改善，可能是其產(chǎn)生腎保護(hù)作用的機(jī)制。本研究體現(xiàn)出中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)和多效性的特色和優(yōu)勢(shì)，而中西藥聯(lián)合為優(yōu)選方案，對(duì)臨床治療有一定的指導(dǎo)意義。