楊 寶，王 婧，陳 超，周 潔，李 海

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，寧夏 銀川 750004；3.江蘇省人民醫(yī)院普外科，江蘇 南京210029

隨著中國(guó)人生活水平的不斷提高，老年患者中結(jié)直腸腫瘤的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢(shì)。目前對(duì)于中晚期結(jié)直腸癌患者尚無(wú)統(tǒng)一有效的治療方法，探索影響結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展的因子，有利于提高老年患者的治療效果及生存率。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）因其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵作用，成為研究熱點(diǎn)。之前研究［1］表明，HIF-1α也會(huì)影響結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。腫瘤細(xì)胞惡性增殖數(shù)量短時(shí)間內(nèi)激增，血管供氧不足，造成局部缺氧環(huán)境，而有研究［1］發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在這種缺氧環(huán)境中表達(dá)異常增高。HIF-1α可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，ⅤEGF）的產(chǎn)生，為腫瘤的增殖提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［2］。而在這些研究中，大部分僅局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)證明HIF-1α在腫瘤中的作用。本文通過(guò)裸小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)，將人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞注入到裸小鼠體內(nèi)，來(lái)探討HIF-1α對(duì)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞成瘤性的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HCT116細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC），BALB/c裸小鼠（雄）30只購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自甘肅海基生物科技有限公司，McCoy’s 5A培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，兔多克隆抗體（HIF-1α）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

HCT116細(xì)胞保存在液氮罐中，取出后馬上37 ℃水浴鍋中復(fù)蘇，待凍存管中液體完全溶解后，在超凈工作臺(tái)無(wú)菌條件下將細(xì)胞移至5 mL離心管中。1 000 r/min離心5 min后棄上清液，加入適量培養(yǎng)基充分吹打混勻后轉(zhuǎn)入含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、2.5%青霉素、2.5%鏈霉素的McCoy’s 5A培養(yǎng)基中，然后放至37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d換液1次，細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至80%～90%后傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HCT116細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入適量胰酶消化數(shù)分鐘，待細(xì)胞脫壁后加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基終止胰酶消化，充分吹打后將細(xì)胞移至5 mL離心管中離心。重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取1×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后根據(jù)使用說(shuō)明加入病毒，放至培養(yǎng)箱中繼續(xù)溫育12 h后吸棄上層轉(zhuǎn)染液，加入含10%FBS的McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)。si-HIF-1α由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司合成。si-HIF-1α序列：5’-CTGATGACCAGCAACTTGA-3’。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)蛋白的水平

細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，使用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，BCA法蛋白定量后，100 Ⅴ電壓下行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）1 h，轉(zhuǎn)膜后TBST封閉1 h，加入HIF-1α抗體，4 ℃溫育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入二抗后室溫下溫育1 h，TBST洗膜3次，采用電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）法顯影。條帶結(jié)果灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析，結(jié)果計(jì)算目的蛋白灰度值與相應(yīng)內(nèi)參灰度值之比，取平均值。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)mRNA的表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，提取細(xì)胞RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板行RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞HIF-1α mRNA的表達(dá)情況。RT-PCR條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。計(jì)算公式：ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，RQ=2-ΔΔCt，將對(duì)照組目的基因mRNA相對(duì)水平作為1。

1.2.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞以2 000 r/min懸浮離心5 min，收集細(xì)胞。然后PBS洗滌，離心細(xì)胞2次（2 000 r/min，5 min），收集1～5×105個(gè)細(xì)胞。分別加入500 μL的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，5 μL Annexin Ⅴ-FITC混勻細(xì)胞，5 μL PI再次混勻細(xì)胞后，室溫、避光反應(yīng)5～15 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2.6 裸小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 裸小鼠的飼養(yǎng)

裸小鼠在無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)。裸小鼠分為3組：空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，分別注射對(duì)應(yīng)組別的細(xì)胞，每組裸小鼠10只。飼料及飲用水須滅菌，控制裸小鼠飼養(yǎng)環(huán)境的溫度、氧氣、濕度恒定。當(dāng)裸小鼠生長(zhǎng)至8周齡后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.6.2 移植瘤模型的建立

3組細(xì)胞制成懸液，用潔凈1.5 mL Ependorf試管保存置于冰上，然后將懸液與基質(zhì)膠混勻迅速接種。每只裸小鼠在右前肢背部的皮下注射約2×106個(gè)細(xì)胞。接種后觀察裸小鼠腫瘤形成及生長(zhǎng)情況，飼養(yǎng)方式不變，在接種約1周后判斷是否成瘤，每周測(cè)量裸小鼠瘤體的體積（體積=1/2×長(zhǎng)×寬2）［3］。瘤體形成、生長(zhǎng)4周后，裸小鼠麻醉后處死，取出裸小鼠皮下瘤體稱重。將取出的瘤體放入凍存管標(biāo)記后迅速投入到液氮中貯存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOⅤA），并用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HIF-1α的蛋白和mRNA水平

采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，并通過(guò)鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度以判斷轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。在Western blot實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組（PBS組）、si-NC組及si-HIF-1α組中HIF-1α蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.85±0.06、0.79±0.07和0.37±0.08?？瞻讓?duì)照組（PBS組）的HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量與si-NC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，si-HIF-1α組的HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組（PBS組）相比顯著降低（t=3.82，P＜0.01），與si-NC組相比也顯著降低（t=4.89，P＜0.01），表明轉(zhuǎn)染si-HIF-1α可特異性降低細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)量，沉默效率為56.5%。RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組（PBS組）、si-NC組及si-HIF-1α組的HIF-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為5.95±1.36、5.71±1.22和1.74±0.42?？瞻讓?duì)照組（PBS組）的HIF-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量與si-NC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，si-HIF-1α組的HIF-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組（PBS組）相比顯著降低（t=4.64，P＜0.01），與si-NC組相比也顯著降低（t=3.71，P＜0.01），沉默效率為70.8%。通過(guò)Western blot和RT-PCR的檢測(cè)證明，細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，HIF-1α的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HIF-1α的表達(dá)水平Fig.1 Expression level of HIF-1 α after transfection

2.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，空白對(duì)照組凋亡率為1.3%±0.7%，實(shí)驗(yàn)組為11.1%±1.6%，與空白對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.001），陰性對(duì)照組凋亡率為3.5%±0.8%，與空白對(duì)照組相比未顯著升高（P＞0.05，圖2）。

圖2 Annexin Ⅴ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡Fig.2 Apoptosis was detected by Annexin Ⅴ-FITC/PI flow cytometry in each group

2.3 裸小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)

2.3.1 裸小鼠成瘤情況

裸小鼠接種1周后觀察各組成瘤情況，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組中10只裸小鼠全部成瘤；實(shí)驗(yàn)組中9只成瘤，1只未成瘤。前期裸小鼠精神尚可，后期精神萎靡、納差，在此期間未見(jiàn)死亡裸小鼠（表1）。

表1 裸小鼠成瘤情況Tab.1 Tumorigenesis in nude mice

2.3.2 瘤體體積的變化

在瘤體形成后，連續(xù)4周對(duì)瘤體的體積進(jìn)行測(cè)量，得到瘤體體積（表2），并繪制生長(zhǎng)曲線圖（圖3）。將每周的瘤體測(cè)量值比較后可以看到，與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的瘤體體積增加較為緩慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 每周的瘤體體積Tab.2 Tumor volume per week()

表2 每周的瘤體體積Tab.2 Tumor volume per week()

圖3 瘤體生長(zhǎng)曲線圖Fig.3 Growth curve of tumor

2.3.3 瘤體質(zhì)量的比較

裸小鼠成瘤4周后，裸小鼠麻醉處死后取瘤體稱重。得出各組的瘤體質(zhì)量（表3），并繪制瘤體質(zhì)量半定量分析圖（圖4）。與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的瘤體質(zhì)量較低（P＜0.05）；而陰性對(duì)照組的瘤體質(zhì)量與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組的瘤體質(zhì)量Tab.3 Tumor weight in each group()

表3 各組的瘤體質(zhì)量Tab.3 Tumor weight in each group()

圖4 各組的瘤體質(zhì)量比較Fig.4 Comparison of tumor weight in each group

3 討論

HIF-1α是治療腫瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)，目前已經(jīng)得到許多研究者的證實(shí)［4］。在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中，HIF-1α的表達(dá)水平異常增高，可以激活基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、ⅤEGF和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)因子等，使腫瘤細(xì)胞獲得增殖、遷移和侵襲的能力［5-7］。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)［2］已經(jīng)揭示了其發(fā)揮功能的相關(guān)機(jī)制。而本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)探討HIF-1α在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，本研究成功構(gòu)建了細(xì)胞和裸小鼠的相關(guān)模型，通過(guò)比較分析，探討HIF-1α在結(jié)直腸腫瘤的作用。

裸小鼠致瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中裸小鼠瘤體的體積增加較慢，瘤體質(zhì)量較低，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些研究結(jié)果表明，下調(diào)HIF-1α在結(jié)直腸腫瘤中的表達(dá)，能夠有效抑制瘤體的增殖，這與體外細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果是一致的，提示HIF-1α在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)瘤體內(nèi)HIF-1α表達(dá)水平降低時(shí)，其下游因子MMP和ⅤEGF的表達(dá)受到抑制。ⅤEGF作為一種生長(zhǎng)因子，具有高度特異性［8］，能夠增加血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)變性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用［9-11］。MMP家族如MMP2，能夠?qū)⒓?xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中的蛋白成分降解，使得能夠阻滯腫瘤細(xì)胞侵襲的組織屏障受到破壞，并且使細(xì)胞的黏附力得到增強(qiáng)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力［12］。而且MMP2還能促進(jìn)合成和釋放多種能夠調(diào)控血管生長(zhǎng)的因子（如ⅤEGF等），促進(jìn)血管生成，激發(fā)潛在的生物活性［13］。在正常腫瘤生長(zhǎng)低氧環(huán)境下，ⅤEGF能夠調(diào)節(jié)血漿酶原活化因子和血漿酶原活化因子抑制因子-l的mRNA水平升高，從而增強(qiáng)血漿酶原活化因子的生物活性，促進(jìn)細(xì)胞外蛋白的水解，進(jìn)而催生新的毛細(xì)血管［14］。因而一旦ⅤEGF的活性受到抑制，不能為腫瘤的生長(zhǎng)形成新生血管，就會(huì)導(dǎo)致腫瘤增殖障礙。本研究實(shí)驗(yàn)組中的1只裸小鼠成瘤失敗可能與上述原因相關(guān)。

綜上所述，結(jié)直腸腫瘤中HIF-1α的下調(diào)可以抑制瘤體的生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡。本文為HIF-1α作為癌癥治療的靶點(diǎn)提供了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。