肖 鋒，肖靜文，邵建國，陳麗燕，顧春燕

1.南通大學附屬南通第三醫(yī)院，南通市第三人民醫(yī)院病理科，江蘇 南通 226006；2.南通大學附屬南通第三醫(yī)院，南通市第三人民醫(yī)院消化科，江蘇 南通 226006

目前原發(fā)性肝癌是中國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，嚴重威脅中國人民的生命健康［1］。肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的組織學類型。研究表明，HCC患者在腫瘤生長的免疫監(jiān)測中常發(fā)現(xiàn)功能缺陷，其中的機制包括部分抗原掩蔽、抗原處理失敗、效應細胞抑制和協(xié)同刺激不足［2］。

程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）是一種共抑制受體分子，在活化的T淋巴細胞和B淋巴細胞中被誘導表達，在調(diào)節(jié)外周免疫耐受中發(fā)揮重要作用［3-4］。程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）在樹突狀細胞、巨噬細胞和實質(zhì)細胞中表達。有證據(jù)［5］表明，PD-L1可通過誘導T淋巴細胞凋亡、失能、無應答和功能衰竭，向表達PD-1的T淋巴細胞傳遞抑制信號，從而抑制免疫應答，因此PD-1/PD-L1在調(diào)節(jié)宿主免疫應答中發(fā)揮關鍵作用。然而，HCC腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-1的表達狀態(tài)與腫瘤免疫主要效應細胞CD8+T淋巴細胞的關系尚不清楚，通過PD-1/PD-L1途徑發(fā)揮免疫抑制作用的CD8+T淋巴細胞功能的變化仍有待闡明。因此，本研究旨在探討PD-1在腫瘤浸潤淋巴細胞中的表達情況，分析其表達狀態(tài)與HCC臨床病理學參數(shù)、PD-L1的表達、CD8+T淋巴細胞之間的相關性及與患者預后的相關性，采用免疫組織化學雙標記法檢測CD8+PD-1+雙陽性T淋巴細胞密度對HCC患者預后的影響，旨在為HCC治療提供一個潛在的免疫調(diào)節(jié)靶點。

1 資料和方法

1.1 病例資料

病例納入標準：①2008年1月—2016年12月于南通市第三人民醫(yī)院接受手術治療的所有HCC患者；② 經(jīng)病理學檢查證實為HCC；③術前未接受任何抗腫瘤治療；④ 有完整的臨床及隨訪資料；⑤ 患者簽署知情同意書；⑥ 通過醫(yī)院倫理委員會批準。排除標準：①復發(fā)性HCC；② 術前接受介入、化療等抗腫瘤治療的患者。共入組344例患者，其中男性271例，女性73例。平均年齡55.3歲。乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）陽性278例。有肝硬化289例。隨訪時間為8～114個月。

1.2 組織芯片的制備

組織芯片的制備由上海芯超生物科技有限公司協(xié)助完成。步驟為：對納入病例的H-E染色病理切片重新閱片，標記H-E染色病理切片及對應蠟塊上的代表性位置。用打孔儀在樣本蠟塊上打孔、細針吸取組織，按照排列順序裝載在芯片蠟塊中。每例樣本均設置3個復點。

1.3 免疫組織化學法檢測

抗原修復采用高壓修復法，在乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）（pH=9.0）中消化3 min；之后將樣本與H2O2一起溫育15 min。采用EnⅤision免疫組織化學染色法：一抗分別為小鼠抗PD-1單克隆抗體（1∶100，北京中杉金橋生物技術有限公司）、兔抗PD-L1單克隆抗體［1∶50，基因科技（上海）股份有限公司］和兔抗CD8單克隆抗體（1∶100，北京中杉金橋生物技術有限公司），室溫溫育2 h，然后用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗（德國Leica公司）室溫溫育30 min，最后用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色。

免疫組織化學雙染色法：按稀釋比例同時加入小鼠抗PD-1抗體和兔抗CD8抗體兩種一抗，室溫溫育2 h后，滴加堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）標記山羊抗小鼠二抗和HRP標記的山羊抗兔二抗兩種二抗，室溫溫育30 min；用GBI-久紅顯色5 min、沖洗，隨后DAB顯色5 min。用蘇木精復染。

1.4 結(jié)果判定

腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-1的存在表現(xiàn)為為細胞膜或細胞質(zhì)染色：依據(jù)參考文獻［6］的方法，用組織芯片計數(shù)PD-1+淋巴細胞數(shù)量，然后根據(jù)PD-1+細胞計數(shù)，大于中位數(shù)判為高表達組，小于等于中位數(shù)判為低表達組。

腫瘤細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-L1通過評估染色細胞的百分比（PD-L1陽性腫瘤細胞數(shù)/所有腫瘤細胞數(shù)或PD-L1陽性腫瘤浸潤淋巴細胞數(shù)/所有腫瘤浸潤淋巴細胞數(shù)）來量化。當≥1%的腫瘤細胞中PD-L1呈陽性反應時，腫瘤細胞被判定為PD-L1陽性表達，判斷標準為腫瘤細胞的細胞膜或細胞質(zhì)部分或完全染色。腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-L1陽性表達判斷標準為細胞膜或細胞質(zhì)染色陽性細胞數(shù)≥1%［7］。

腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞密度、CD8+PD-1+雙陽性T淋巴細胞密度判定：計數(shù)組織芯片各點CD8+淋巴細胞、CD8+PD-1+雙陽性細胞數(shù)量，計算免疫反應細胞的平均計數(shù)，大于平均計數(shù)判為高密度組，小于等于平均計數(shù)判為低密度組。

結(jié)果由兩名高年資病理科醫(yī)師采用雙盲法評估，可疑病例由兩名醫(yī)師使用多頭顯微鏡討論，直到達成共識。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。PD-1表達與臨床病理學參數(shù)等之間的相關性用χ2檢驗評價。采用Kaplan-Meier法計算總生存率并繪制生存曲線，組間比較用log-rank檢驗。采用單因素和多因素COX回歸分析判斷是否為獨立預后因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1在HCC腫瘤浸潤淋巴細胞中的表達及與臨床病理學參數(shù)的關系

免疫組織化學染色顯示，PD-1表達于HCC腫瘤浸潤淋巴細胞的細胞膜或細胞質(zhì)中（圖1），腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-1的陽性率為43.9%（151/344）。PD-1高表達與腫瘤組織學分級有關（P=0.009，表1），與年齡、性別、HBsAg、腫瘤大小、有無肝硬化及微血管侵犯等臨床病理學參數(shù)無明顯相關性。

2.2 PD-1在HCC腫瘤浸潤淋巴細胞中的表達與PD-L1表達、腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞密度的關系

腫瘤細胞中PD-L1的陽性率為21.8%（75/344），腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-L1的陽性率為47.1%（162/344），腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞高密度率為45.3%（156/344）。PD-1高表達與腫瘤細胞中PD-L1的表達（P＜0.001）、腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-L1的表達（P＜0.001）及腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞密度相關（P=0.003，圖1，表1）。

圖1 免疫組織化學法標記PD-1、PD-L1和CD8的表達情況Fig.1 Expressions of PD-1,PD-L1 and CD8 detected by immunohistochemistry

表1 PD-1的表達與HCC患者臨床病理學參數(shù)、PD-L1表達及腫瘤浸潤CD8+ T淋巴細胞的關系Tab.1 Relationship between PD-1 expression and clinicopathological parameters,PD-L1 expression and tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes in HCC patients(n)

續(xù)表 1

2.3 PD-1高表達與HCC預后的關系

Kaplan-Meier生存分析顯示，PD-1高表達組HCC患者的OS和DFS較PD-1低表達組明顯降低（P均＜0.001）。單因素COX回歸分析顯示，腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-1高表達是OS和DFS的不良預后因子（OS：HR=2.344，P＜0.001；DFS：HR=2.750，P＜0.001），腫瘤＞3 cm、組織學分級高、有微血管侵犯及腫瘤細胞中PD-L1的表達是OS和DFS的不良預后因子，并且低密度腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞是DFS的不良預后因子。為評估可能存在的混雜變量，對單變量COX比例風險分析中達到顯著性的因素，以及具有臨床意義的指標HBsAg、肝硬化等因素采用多變量COX回歸分析，結(jié)果顯示，腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-1高表達是OS和DFS的獨立不良預后因子（OS：HR=1.654，P=0.010；DFS：HR=2.518，P＜0.001，圖2，表2～3）。

圖2 PD-1的表達水平對HCC患者預后的預測價值Fig.2 The prognostic value of PD-1 expression in HCC patients

表2 單因素和多因素COX回歸分析OS預測因子Tab.2 Univariate and multivariate COX regression analyses of OS predictors

表3 單因素和多因素COX回歸分析DFS預測因子Tab.3 Univariate and multivariate COX regression analyses of DFS predictors

2.4 腫瘤浸潤CD8+ PD-1+雙陽性T淋巴細胞密度對HCC預后的影響

腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞對腫瘤患者生存的影響一直備受關注。有研究表明，腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞密度與多種實體瘤類型的良好預后相關［8-9］，也與化療和免疫治療反應的改善相關［10］。本研究數(shù)據(jù)顯示，高密度腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞組DFS較低密度組明顯改善（P＜0.001），并且OS亦優(yōu)于低密度組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。進一步對高密度腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞組HCC患者用免疫組織化學雙染色法檢測CD8+PD-1+雙陽性腫瘤浸潤T淋巴細胞的密度，結(jié)果顯示，高密度CD8+PD-1+T淋巴細胞組較低密度組OS和DFS更差（P均＜0.001，圖3～4）。

圖3 免疫組織化學雙標記CD8（棕色）、PD-1（紅色）染色Fig.3 Immunohistochemical double labeled CD8 (brown) and PD-1 (red) staining

圖4 CD8+ PD-1+雙陽性T淋巴細胞密度對HCC患者預后的預測價值Fig.4 The prognostic value of CD8+ PD-1+ double expression T lymphocyte density in HCC patients

3 討論

本研究檢測了HCC患者腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-1的表達情況，結(jié)果顯示，PD-1高表達與腫瘤組織學分級、腫瘤細胞中PD-L1的表達、腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-L1的表達及腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞密度有關，同時PD-1高表達是OS和DFS的不良預后因子。此外，腫瘤浸潤CD8+PD-1+T淋巴細胞的增加可以預測疾病進展和術后復發(fā)。

HCC通常是在慢性肝?。砸倚透窝谆虮透窝撞《靖腥?、代謝紊亂或慢性乙醇性肝損害）的基礎上發(fā)展而來的，因其促進了肝臟的免疫抑制狀態(tài)和T淋巴細胞功能衰竭［11］。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，肝臟微環(huán)境中有效的抗腫瘤免疫監(jiān)視功能受損，免疫檢查點尤其是PD-1/PD-L1信號通路參與了這一過程［12］。

有研究［13］顯示，在非小細胞肺癌患者腫瘤組織中，高密度腫瘤浸潤PD-1+T淋巴細胞組比低密度組有更高的腫瘤識別能力和明顯不同的預后，其中高密度PD-1+T淋巴細胞能預測患者的治療反應和存活率。在HCC患者中，PD-1在CD8+T淋巴細胞中的表達增加與術后復發(fā)有關［14］；在未經(jīng)免疫治療的HCC患者中，循環(huán)和腫瘤浸潤CD8+PD-1+T淋巴細胞的密度增加與肝切除術后的進展相關［15］，這與本研究結(jié)論一致。同時，表達PD-1的腫瘤浸潤T淋巴細胞的數(shù)量被證明可以預測PD-1阻斷后的臨床治療效果［16］，并且腫瘤對PD-1阻斷的反應取決于預先存在的CD8+T淋巴細胞的狀態(tài)，這些細胞受到PD-1/PD-L1介導的適應性免疫抵抗的負調(diào)節(jié)［17］。

對于HCC患者中PD-1/PD-L1通路在CD8+T淋巴細胞和腫瘤細胞之間的作用機制尚不清楚。有研究［18-19］顯示，HCC腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞中PD-1不同表達水平的亞群具有不同的基因表達模式，高表達PD-1的CD8+T淋巴細胞亞群具有高水平的調(diào)節(jié)T淋巴細胞衰竭的基因模式，其通過產(chǎn)生低濃度的γ-干擾素和腫瘤壞死因子發(fā)揮功能，用抗PD-1的抗體溫育該亞群細胞可部分恢復細胞因子的產(chǎn)生，因而具有高表達PD-1的CD8+T淋巴細胞亞群的HCC患者可能對于免疫檢查點阻斷劑的聯(lián)合治療效果更為明顯，同時，PD-L1在HCC中的表達可抑制T淋巴細胞在微環(huán)境中的功能，本研究顯示，腫瘤細胞中PD-L1高表達為HCC患者復發(fā)的預測因子，這與之前的研究結(jié)論［20］一致。對HCC切除術后標本的分析顯示，PD-L1高表達與未進一步接受過免疫治療的患者的腫瘤侵襲性和預后不良有關［21］。

綜上所述，PD-1在腫瘤浸潤淋巴細胞中顯著上調(diào)，尤其是在效應CD8+T淋巴細胞中。這種PD-1表達的增加可能是HCC患者預后不良的原因。進一步通過多變量分析來證實PD-1+和CD8+PD-1+免疫浸潤T淋巴細胞的預后價值，并強調(diào)與HCC腫瘤細胞中PD-L1表達的顯著相關性。這些發(fā)現(xiàn)拓展了我們對HCC患者抗腫瘤反應過程中HCC細胞與CD8+T淋巴細胞間PD-1/PD-L1相互作用的認識。