韓 睿,趙孟良,2,孫世英,任延靖,2

(1.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院，青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810016; 2.青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810016)

大白菜(BrassicarapaL. ssp.pekinensis)屬十字花科(Brassicaceae burnett)蕓薹屬(Brassica)兩年生作物，原產(chǎn)中國北方，是消費(fèi)量巨大且栽培歷史悠久的主要蔬菜作物之一；其全國每年播種面積近266.7hm2，產(chǎn)值在600億元以上，占全國蔬菜總播種面積的15%左右[1]。大白菜營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素、纖維素和礦物質(zhì)等，具有養(yǎng)胃生津、利尿通便和清熱解毒等功效。目前國內(nèi)大白菜品種很多，根據(jù)葉球類型可分為樁型、筒型和頭球型；根據(jù)葉球顏色可分為白色、黃色、橙色、橘紅色和紫色[2]。據(jù)統(tǒng)計，市場上有50余種不同類型的白菜品種[1]。

針對大白菜品種的研究主要集中在品種的評價與鑒定方面。孟淑春等[3]對65份大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在絨毛、中肋色、中肋長度、葉球質(zhì)量和葉長等性狀間存在較大的極差；趙美華等[4]利用AFLP標(biāo)記對41份山西大白菜進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)平頭型大白菜遺傳多樣性最為豐富，短筒型遺傳多樣性最為狹窄；原靜云等[5]利用33對SSR引物對49個大白菜自交系的遺傳多樣性進(jìn)行研究，表明品種間的遺傳距離變異為0～0.93；段麗麗等[6]利用30對SSR引物分析了46份大白菜品種的遺傳多樣性，認(rèn)為等位基因多樣性指數(shù)分布范圍為0.485～0.817。吳錦國[7]對4個大白菜品種進(jìn)行了比較試驗(yàn)，為廣大農(nóng)戶按市場需求選擇不同的大白菜品種提供科學(xué)依據(jù)。

綜上，目前國內(nèi)大白菜品種的研究大多數(shù)集中在品種的評價研究，而對于青海地區(qū)大白菜的引種栽培研究較少，且未見農(nóng)藝性狀與分子標(biāo)記對引種后大白菜進(jìn)行綜合研究的報道，因此本試驗(yàn)通過引入47份內(nèi)地大白菜品種到青海高原，對其引種栽培后進(jìn)行農(nóng)藝性狀的調(diào)查，利用SSR分子標(biāo)記研究引種大白菜品種間的親緣關(guān)系，并綜合分析農(nóng)藝性狀及分子標(biāo)記結(jié)果以期篩選出適宜青海高原地區(qū)種植的大白菜品種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的47份大白菜品種信息見表1。所有材料于2019年6月18日育苗，7月23日定植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院園藝所試驗(yàn)基地，試驗(yàn)地栽培管理?xiàng)l件一致[8]。

表1 供試的47份大白菜材料Table 1 47 tested Chinese cabbage materials

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查 參照李錫香《白菜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[9]的方法對所有白菜品種30個農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查分析，包括14個數(shù)量性狀及16個質(zhì)量性狀。數(shù)量性狀通過卷尺(精度0.1 cm)及游標(biāo)卡尺(精度0.01 mm)進(jìn)行測量測定；其中所涉及的相關(guān)質(zhì)量性狀進(jìn)行賦值見表2。

1.2.2 病害調(diào)查 對成熟期白菜主要發(fā)生的軟腐病、病毒病、黑點(diǎn)病等主要病害進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查。根據(jù)小區(qū)單株病害葉面積及株數(shù)計算病情指數(shù)，按照0、1、3、5、7、9級的病害分級標(biāo)準(zhǔn)對所有病害進(jìn)行統(tǒng)計，病情指數(shù)的計算公式如下：

病情指數(shù)(DI)= (該病級值×各級發(fā)病株數(shù))/(最高級值×調(diào)查總株數(shù))×100[10]

根據(jù)病情指數(shù)，將大白菜的抗病性分為5級，其中高抗(HR)：0<病情指數(shù)<5；抗病(R)：5<病情指數(shù)<20；中抗(MR)：20<病情指數(shù)<40；感病(S)：40<病情指數(shù)<60；高感(HS)：病情指數(shù)>60[11]。

1.2.3 SSR分子標(biāo)記鑒定引種白菜間的親緣關(guān)系 供試葉片無病蟲害感染，經(jīng)液氮迅速冷凍后-80 ℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。用改良的CTAB法提取白菜葉片的基因組DNA[12]，用1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度及完整性，微量紫外分光光度計檢測DNA濃度及質(zhì)量，-20 ℃保存。

PCR擴(kuò)增體系為：上下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix 5 μL，DNA 1 μL，加ddH2O補(bǔ)至10 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，52～57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)29次；72 ℃再延伸10 min。取1 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓220 V，時間70 min。硝酸銀染色及堿性甲醛溶液顯色，拍照保留并統(tǒng)計條帶[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計整理，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括多樣性分析，主成分分析，隸屬函數(shù)分析，以及相關(guān)性分析和基于UPGMA的系統(tǒng)聚類分析。

多樣性分析公式：H′=-∑piInPi，式中Pi為某一性狀在第i個級別出現(xiàn)的頻率。

隸屬函數(shù)計算公式[14]：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中Xi為指標(biāo)測定值，Xmax、Xmin為所有參試材料某一指標(biāo)的最大值和最小值。電泳條帶用人工讀帶的方法，觀察電泳結(jié)果，記錄清晰可重復(fù)的條帶，清晰且可重復(fù)的條帶記為“1”，弱帶且不重復(fù)或無條帶出現(xiàn)記為“0”，形成“0、1”數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計擴(kuò)增帶總數(shù)和特異條帶數(shù)目，計算多態(tài)性比率，利用SPSS 20.0軟件構(gòu)建白菜供試品種材料基于UPGMA的聚類系譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試白菜數(shù)量性狀多樣性分析

對14個數(shù)量性狀的多樣性分析可知(表2)，多樣性指數(shù)(H′)主要分布于0.65～1.49，平均值為1.23，其中外葉寬最高，多樣性指數(shù)為1.49，其次是株幅(1.47)和球葉數(shù)(1.45)，除此之外，株高、葉球橫徑、中肋長、單株總質(zhì)量、凈菜率共8項(xiàng)性狀的多樣性指數(shù)都超過平均值，而中肋厚和中心柱長的多樣性指數(shù)小于1.00，分別為0.65和0.98。這些性狀的變異系數(shù)分布于0.12～0.64，以中心柱長的變異系數(shù)最大，達(dá)到0.64，凈菜率和株幅的變異差異較小，均為0.12。

表2 47份大白菜品種數(shù)量性狀的多樣性分析Table 2 Diversity analysis of quantity traits in 47 different Chinese cabbage varieties

2.2 大白菜質(zhì)量性狀多樣性分析

對47份大白菜的16個質(zhì)量性狀分析表明，大部分質(zhì)量性狀均能體現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性(表3)，結(jié)果表明多樣性指數(shù)分布于0.42～2.04，平均值為1.11，其中多樣性指數(shù)最大的性狀是葉球形狀(2.04)，說明供試的白菜葉球形狀豐富；其中近圓球形的占比27%；其次是卵圓形，占15%；矮樁形占13%；剩余45%由炮彈形、短筒形、長筒形、高壇形、倒卵形和倒錐形組成。商品熟性的多樣性指數(shù)為1.54，主要集中在中早熟、中熟品種，分別為35%和31%，抽薹性多樣性指數(shù)為1.37，中熟抽薹的品種占42%，中晚熟抽薹品種占38%，抽薹期總體較集中，大多數(shù)白菜品種對青海秋季氣溫適應(yīng)性較好。

表3 大白菜品種質(zhì)量性狀的分布與多樣性Table 3 Distribution and diversity of quality traits in Chinese cabbage

(續(xù)表3 Continued table 3)

2.3 主成分分析

以特征值大于1.0為標(biāo)準(zhǔn)提取主成分，對47個品種白菜的14項(xiàng)數(shù)量性狀進(jìn)行主成分分析，提取4個綜合指標(biāo)，結(jié)果顯示累計貢獻(xiàn)率達(dá)到 74.2%(表4)，即4個復(fù)合指標(biāo)可代表原始變量的大部分信息。第1主成分特征值為4.92，方差貢獻(xiàn)率最大(35.13%)，主要包括株高(0.90)、外葉長(0.89)、葉球縱徑(0.82)、葉球質(zhì)量(0.78)、株幅(0.76)、單株總質(zhì)量(0.75)，這6項(xiàng)指標(biāo)占據(jù)著主導(dǎo)地位，主要反映了與形態(tài)相關(guān)的4項(xiàng)性狀，以及與質(zhì)量相關(guān)的2項(xiàng)性狀；第2主成分主要包括中肋長(-0.713)、葉球橫徑(0.685)、球葉數(shù)(0.616)，特征值為2.71，方差貢獻(xiàn)率為19.37%；其他主成分方差貢獻(xiàn)率較小。

表4 大白菜性狀的主成分分析Table 4 Principal component analysis table of Chinese cabbage characters

2.4 隸屬函數(shù)分析

隸屬函數(shù)是把多個性狀綜合起來在同一個系統(tǒng)中進(jìn)行分析，反映品種的綜合優(yōu)良性狀，是綜合評價分析中的重要分析方法。47份白菜的隸屬函數(shù)值均為0.18～0.53，‘天青78’和‘天津綠’均為0.53，‘京箭70’隸屬函數(shù)均值達(dá)到0.50，這3個品種均為長筒狀，有較高的株高，中肋長而不厚，半結(jié)球型，葉球較松散，單株總質(zhì)量偏低，‘精純膠蔬秋’‘津耘白75’和‘膠蔬秋季王’有較高的隸屬函數(shù)值，均來自天津和山東的優(yōu)良品種，而隸屬函數(shù)值最低的‘碧玉’為0.18，‘碧玉’和‘早熟5號’屬于早熟品種，在秋季氣溫降低后易出現(xiàn)抽薹現(xiàn)象，商品性較差。

2.5 47份白菜數(shù)量性狀的相關(guān)性分析

對47份白菜品種的13個數(shù)量性狀進(jìn)行相關(guān)分析，得到各性狀的相關(guān)系數(shù)矩陣，數(shù)據(jù)顯示47個品種的性狀之間存在不同程度的相關(guān)性。其中株高與外葉長極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.947，葉球質(zhì)量決定單株質(zhì)量的大小，相關(guān)系數(shù)達(dá)到 0.935。葉球縱徑與株高呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.861，外葉長與葉球縱徑相關(guān)系數(shù)達(dá) 0.841，呈極顯著正相關(guān)，同時，株幅與株高也呈極顯著正相關(guān)(0.673)，株幅與外葉長和外葉開展度有關(guān)。植株的生長發(fā)育過程中，大白菜的株高、外葉長及葉球縱徑之間緊密相關(guān)，因此可以由外葉長預(yù)估葉球的大小。

2.6 主要病害分析

對成熟期白菜病害情況進(jìn)行統(tǒng)計，根據(jù)病斑面積對病情進(jìn)行分級，利用公式計算各病害的病情指數(shù)(DI)。其中5個大白菜品種有低程度霜霉病，病情指數(shù)均小于20，屬于抗病品種。有低程度感染黑斑病的有6個大白菜品種，病情指數(shù)小于20。軟腐病中抗(MR)品種有‘高山娃娃菜’‘新域京56’和‘京春黃3號’；感病(S)品種為‘金抗678’，病情指數(shù)為46.46；‘春喜大白菜’病情指數(shù)達(dá)到80.00，屬于高感(HS)品種，不宜種植，其余6個感染品種程度較輕，病情指數(shù)低于20，是抗病品種?！缶G秋黃’有較嚴(yán)重的病毒病，根據(jù)病情指數(shù)51.52，被認(rèn)為是感病(S)品種，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失甚至絕產(chǎn)?！鹂?78’和‘京春黃3號’均有黑點(diǎn)病，病情指數(shù)分別為27.78和 32.41，屬于中抗品種，黑點(diǎn)病對產(chǎn)量的影響較小，但對其商品性影響較大。

2.7 農(nóng)藝性狀聚類分析

依據(jù)30個性狀數(shù)據(jù)，對47份白菜品種進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，聚類圖(圖1)中在距離系數(shù)為10處，可將供試白菜分為5大類群。第Ⅰ類群可進(jìn)一步分為2個亞群，第一個亞群包括16個品種，主要為中熟品種，葉球質(zhì)量平均為2.15 kg，球葉數(shù)平均值達(dá)到65.31片，其中‘高山娃娃菜’球葉數(shù)平均值高達(dá)78.50；第二個亞群包括14個品種，均表現(xiàn)出中早熟性，葉球質(zhì)量平均值為2.02 kg，球葉數(shù)平均為47.39片。第一亞群與第二亞群的葉球質(zhì)量平均值差僅為0.13 kg，但球葉數(shù)平均值相差17.91，第一亞群中肋厚平均值為 7.79 mm，第二亞群的中肋厚平均值為8.82 mm，所以2個亞群在葉球外觀大小差異并不大，分析其產(chǎn)生差距的原因，是第二類群憑借較高的葉片數(shù)和較厚的中肋增加質(zhì)量。第Ⅱ類群包括‘碧玉’和‘15雜22B’2個品種，這2個品種在試驗(yàn)中表現(xiàn)出易抽薹，其商品性價值較低。第Ⅲ類群的8個品種內(nèi)葉顏色均為黃色，所以聚為同一類群。這一類群的植株均為高產(chǎn)品種，葉球質(zhì)量平均值達(dá)到2.88 kg，球葉數(shù)平均值為83.81片，其中‘京春娃3號’球葉數(shù)高達(dá)92.50片，但是葉球橫縱徑與第一、二類群接近，說明這些品種的葉球緊實(shí)，可作為高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的品種進(jìn)行篩選培育。第Ⅳ類群僅包含‘迷你金娃娃’1個品種，產(chǎn)地為河北，植株較小，屬于娃娃菜品種，但其內(nèi)葉顏色也為黃色，所以與第三類群屬于同一分支。第Ⅴ類群6個品種形態(tài)特征相似，株高平均值達(dá)到 52.34 cm，葉球包心為圓直筒形，植株也呈直立型，葉型緊湊不向外蔓延伸展，葉片呈翠綠色。其中，由于‘京翠70’質(zhì)量較小，成為單獨(dú)的亞群，‘津耘白75’和‘天青78’ 形態(tài)最為相似為同一分支。

2.8 利用SSR分子標(biāo)記分析白菜親緣關(guān)系

2.8.1 SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果 69對SSR引物中有52對引物能夠擴(kuò)增出具多態(tài)性好且清晰的條帶，占供試引物的85.5%。在69個基因座位中共檢測出200條清晰條帶，多態(tài)性條帶171條，各引物擴(kuò)增條帶數(shù)為1～8，平均為2.90條。其中Br02-6擴(kuò)增出8條帶，條帶數(shù)目最多，Br04-5未擴(kuò)增出條帶，Br03-5、Br03-9、Br04-1、Br05-7、Br07-4、Br08-3、Br08-4和Br09-3擴(kuò)增的多態(tài)性條帶百分率達(dá)到100.0%。

引物Br02-6對47個大白菜品種的擴(kuò)增圖譜如圖2。擴(kuò)增得到的DNA片段長度約為100～500 bp。

2.8.2 SSR分子標(biāo)記結(jié)果聚類分析 基于系統(tǒng)聚類法SSR鑒定結(jié)果(圖3)，在距離系數(shù)為23.0處將47分大白菜分為5個類群，第Ⅰ類群包括32個品種，其中‘華耐B1102’‘春玉黃’和‘小寶大白菜’系譜圖中分支最近，表明遺傳背景最為相似；‘精純膠蔬秋’和‘膠蔬秋季王’親緣關(guān)系十分接近，經(jīng)分析，這2個品種外形相似，來源地相同，可能有相同的父本或母本；‘京翠70’被劃分為一個單獨(dú)的群體(Ⅴ)；‘北京桔紅’和‘春大強(qiáng)’劃分為一類(Ⅳ)；‘津耘白75’等8個品種為第Ⅱ類群；第Ⅲ類群包含4個品種，分別是‘京箭70’ ‘京域新56’‘早熟5號’以及‘天青78’，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類群的白菜品種在系譜值為24時在同一分支，系統(tǒng)聚類結(jié)果顯示，來源地接近的品種有較近的親緣關(guān)系。

3 討 論

中國是白菜類蔬菜的起源中心，在長期的自然選擇和進(jìn)化過程中，形成了很多變種，有著非常豐富的種質(zhì)資源，而以往對這些資源的研究和利用大多圍繞選育蔬菜品種而展開，同時，育種方向以高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)為主。因此，在調(diào)查植株農(nóng)藝性狀的選擇上，以體現(xiàn)質(zhì)量及品質(zhì)的性狀為主。

本試驗(yàn)對引種的47個品種大白菜進(jìn)行農(nóng)藝性狀的分析及SSR分子標(biāo)記分析，兩類分析方法均使用相同的聚類方法分類，雖然聚類分析把多個種質(zhì)基本分開，但大部分種質(zhì)的分子標(biāo)記與農(nóng)藝性狀的聚類結(jié)果一致性不高，吳麗艷等[15]對在云南試種的37份茄子資源進(jìn)行相同的分析，研究結(jié)果表明其表型分析結(jié)果與分子標(biāo)記分析結(jié)果相關(guān)性較低，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。本研究大白菜SSR標(biāo)記分析的聚類關(guān)系沒有明顯規(guī)律，類群內(nèi)相似程度較高，有一些不同地理來源的種質(zhì)也聚合在一起，這可能是引物數(shù)量不夠或者是種類不豐富引起的[16]，另外，也有可能是由于不同地域、不同品種間的基因交流頻繁，從而導(dǎo)致不同品種群體間的遺傳分化系數(shù)較低，遺傳差異降低。所以，在今后研究中，有必要選擇覆蓋較大范圍基因組的引物，以保證種質(zhì)遺傳多樣性的評價更為有效。同時，應(yīng)廣泛搜集不同地域的試驗(yàn)材料來源進(jìn)行對照試驗(yàn)，使試驗(yàn)結(jié)果更具普遍性。并用多種分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析，可以同時反映出形態(tài)間和表觀不體現(xiàn)的潛在核酸差異，分析結(jié)果更為準(zhǔn)確[17]。

目前，親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近與品種來源地緊密相關(guān)，但傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果與分子標(biāo)記結(jié)果仍有差異，可能與材料內(nèi)在基因表達(dá)受限或表達(dá)效應(yīng)與外在形態(tài)關(guān)聯(lián)不夠緊密引起[18]。在近年來大白菜的選育中，親本親緣關(guān)系相近導(dǎo)致新品種親緣關(guān)系相近，新品種的選育標(biāo)準(zhǔn)在高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)上應(yīng)該更加多維，以增加遺傳多樣性。品種來源為山東、天津的大白菜在青海地區(qū)生長發(fā)育及綜合品質(zhì)性狀優(yōu)良，可能是山東和天津與青海東部種植區(qū)域緯度接近，日照時長統(tǒng)一，引種易成功[19]，但青海地區(qū)較天津、山東氣候涼爽，晝夜溫差大，上述品種適應(yīng)性更強(qiáng)，所以葉球品質(zhì)良好； 6-9月青海省降雨量和降雨日數(shù)均達(dá)到峰值[20]，夏秋季節(jié)氣候較冷。本試驗(yàn)中，白菜經(jīng)一個月育苗，7月23日定植于露地，10月22日開始調(diào)查農(nóng)藝性狀，成熟率達(dá)到80%，所以青海地區(qū)7月底可作為白菜定植最末期，適合春季播種的大白菜生長的有效溫度(13 ℃<日溫<22 ℃)的天數(shù)約90 d，適播期為4月下旬到6月初；收獲期約為6月中旬到7月中旬，適宜作為反季節(jié)蔬菜，北菜南運(yùn)[21]。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)地位于青海省西寧市，屬大陸性高原半干旱氣候，全年降雨量主要集中在6-9月，占全年降水量的65%以上，日照時間較長，日照輻射強(qiáng)，日溫差大，無霜期100～200 d。氣候冷涼，適宜種植中晚熟抗旱、抗寒、不耐熱的大白菜品種。本研究表明青海地區(qū)適宜種植筒狀結(jié)球白菜，‘天津綠’和‘天青78’均為品質(zhì)優(yōu)異的品種，結(jié)球緊實(shí)，株幅較小可有效合理密植，且地區(qū)接受度較高。同時，球形的白菜品種如‘精純膠蔬秋’結(jié)球緊實(shí)且抗病性高，易于管理，這些品種為高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的中、晚熟品種，對試驗(yàn)地晝夜溫差大以及長日照的條件有良好的適應(yīng)性，是青海耕地地區(qū)適宜推廣種植的白菜品種。大部分品種農(nóng)藝性狀聚類結(jié)果與分子標(biāo)記聚類結(jié)果一致性較低，其表型差異與SSR遺傳差異不一致，但仍可以通過SSR分子標(biāo)記的方法快速鑒定區(qū)分大白菜品種。