王一波，祝 山，郭文通，秦虎強(qiáng)，劉 巍，徐亮勝，黃麗麗

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

獼猴桃是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，憑借其風(fēng)味獨(dú)特、維生素C含量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，已經(jīng)成為很多地區(qū)脫貧致富的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。但是，由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)引起的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病是制約獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大病害，已造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。該病害發(fā)展迅速、危害嚴(yán)重、防治困難，已在亞、歐、澳、南美洲等地的主要獼猴桃產(chǎn)區(qū)廣泛流行，成為備受關(guān)注的世界性病害。獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病在中國(guó)主要分布于陜西、四川、河南、貴州、浙江等省[3]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)已建立多種基于PCR原理的Psa分子檢測(cè)方法。例如，Yao等[4]建立的四川省Psa病原菌特異性檢測(cè)方法；謝錦添等[5]建立的Psa實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法等。但這些檢測(cè)方法由于依賴價(jià)格昂貴的檢測(cè)設(shè)備，專業(yè)的檢測(cè)步驟，使其廣泛應(yīng)用受到限制。因此，生產(chǎn)中亟需一種靈敏度、特異性、穩(wěn)定性能與PCR檢測(cè)相當(dāng)，且不受實(shí)驗(yàn)設(shè)備限制的檢測(cè)方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是在2000年由Notomi等[6]建立的一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。憑借其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，LAMP檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，逐漸成為可以替代傳統(tǒng)PCR檢測(cè)的新檢測(cè)技術(shù)。LAMP反應(yīng)過程依賴于靶標(biāo)DNA6個(gè)獨(dú)立的區(qū)域，因而其特異性非常高。同時(shí)，LAMP反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行，使用能夠維持穩(wěn)定恒溫的設(shè)備(水浴鍋、保溫桶等)即可完成，而不需要PCR儀等昂貴設(shè)備，從而使檢測(cè)成本大幅降低，應(yīng)用范圍顯著擴(kuò)大；另外，檢測(cè)結(jié)果可通過加入多種染料呈現(xiàn)出可視化[7]。

Ruinelli等[8]已經(jīng)針對(duì)Psa全球主要流行變種(Psa3)，同時(shí)也是中國(guó)主要流行種，設(shè)計(jì)了特異性LAMP檢測(cè)方法，但其檢測(cè)主要采用試劑盒，檢測(cè)結(jié)果判斷依賴熒光定量PCR儀觀察擴(kuò)增曲線，并沒有發(fā)揮LAMP檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)。本研究旨在通過測(cè)試并優(yōu)化該LAMP反應(yīng)體系、簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟、加入熒光染料SYBR green I等手段，來降低反應(yīng)成本，減少操作步驟，建立一種便捷、可視化的LAMP快速檢測(cè)體系。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 試驗(yàn)所使用的5株獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、5株外源對(duì)照菌株均由西北農(nóng)林科技大學(xué)果樹病害病原生物學(xué)及綜合防治研究團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 試劑：LB培養(yǎng)基；Bst 2.0 DNA聚合酶，購(gòu)自NEB公司。dNTP混合液、甜菜堿，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Eva Green，購(gòu)自biotium公司；5×等溫?cái)U(kuò)增緩沖buffer[100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，250 mmol/L KCl，50 mmol/L(NH4)2SO4，0.5% Tween-20)]。

儀器：熒光定量PCR儀(LC-96)購(gòu)，購(gòu)自Roche公司；PCR儀，購(gòu)自thermoFisher公司；引物：參考Ruinelli等[8]的方法，所設(shè)計(jì)引物針對(duì)Psa 3，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 LAMP方法所用引物Table 1 Primer,sequence and length of LAMP

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)及對(duì)照菌株菌懸液制備 取-80 ℃低溫保存的各個(gè)菌液，于LB平板上劃線培養(yǎng)， 25 ℃活化48 h，挑取單菌落，于液體LB培養(yǎng)基中 25 ℃搖培14 h。取100 μL菌懸液置于1.5 mL離心管中，將其于沸水中煮沸15 min，作為DNA模板，備用。

1.2.2 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化 針對(duì)LAMP反應(yīng)主要影響因素，設(shè)置濃度梯度(Mg2+濃度0、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L、6 mmol/L、7 mmol/L；甜菜堿濃度0、0.5 mol/L、1 mol/L、1.5 mol/L、2 mol/L)，檢測(cè)單一變量下，反應(yīng)體系的最優(yōu)反應(yīng)濃度；設(shè)置6個(gè)反應(yīng)溫度(60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、 65 ℃)，反應(yīng)體系中加入Eva Green定量監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，測(cè)試在不同甜菜堿濃度下反應(yīng)最適濃度、不同溫度下反應(yīng)最適溫度及時(shí)間；選擇最優(yōu)反應(yīng)體系、最適反應(yīng)溫度和最短時(shí)間。以標(biāo)準(zhǔn)菌株M228為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌水為陰性對(duì)照。

1.2.3 LAMP特異性測(cè)試 利用建立好的LAMP檢測(cè)體系，在最適溫度下，用不同菌種的DNA模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以滅菌水為陰性 對(duì)照。

1.2.4 LAMP靈敏性測(cè)試 通過分光光度計(jì)測(cè)定M228菌懸液的OD600值，用無菌水將菌懸液濃度調(diào)到OD600=0.1(108CFU/mL)。然后，將菌懸液濃度調(diào)到106CFU/mL，之后按10倍梯度稀釋7個(gè)濃度梯度。利用已建立的LAMP體系進(jìn)行靈敏性測(cè)試，每個(gè)濃度重復(fù)3次，無菌水為陰性對(duì)照。

1.2.5 田間樣品LAMP檢測(cè) 分別于陜西眉縣、周至縣和楊凌區(qū)等地，在獼猴桃果園采集樹皮、根、葉片、果柄組織樣品共122份，其中樹皮樣品45份、根樣品14份、葉片樣品36份、果柄樣品12份、花樣品15份。經(jīng)清水沖洗和75%酒精表面消毒后，用滅菌的手術(shù)刀切下1 cm長(zhǎng)寬的植物組織，切碎并放置于1.5 mL離心管中，加入 1 mL無菌水，靜置10 min后，100℃水浴10 min，以懸浮液為模板，進(jìn)行LAMP檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

研究結(jié)果表明，獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病LAMP檢測(cè)方法最適Mg2+濃度為2 mmol/L(圖1)；最適甜菜堿濃度為1.5 mol/L(圖2-A)；最終確定25 μL反應(yīng)體系為：8 U Bst 2.0 DNA聚合酶，5 μL 5×等溫?cái)U(kuò)增緩沖Buffer，2 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，1.5 mol/L甜菜堿,1.6 μL FIP和BIP,0.2 μL F3和B3，0.4 μL LoopF和LoopB(引物初始濃度為10 μmol/L)，1 μL模板DNA。其反應(yīng)的最適溫度為65 ℃，并在反應(yīng)約 25 min后達(dá)到平臺(tái)期，所以確定反應(yīng)時(shí)間為30 min。

2.2 LAMP特異性檢測(cè)

于最適溫度下測(cè)試的特異性檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3)：只有5株P(guān)sa菌株有明顯的陽(yáng)性結(jié)果，而其他5株對(duì)照菌株及陰性對(duì)照均無顏色變化，表明建立的LAMP檢測(cè)方法具有良好的特異性。

2.3 LAMP靈敏性檢測(cè)

于最適溫度下測(cè)試的靈敏性檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4)：LAMP檢測(cè)結(jié)果在菌懸液濃度分別為106、105、104、103、102CFU/mL時(shí)均可得到陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，因此LAMP檢測(cè)方法最低可以檢測(cè)到102CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液濃度。

2.4 田間樣品LAMP檢測(cè)

田間樣品檢測(cè)結(jié)果顯示(表2)，花樣品共采集并檢測(cè)15份，其中12份為陽(yáng)性結(jié)果，帶菌率為 66.7%；葉片樣品共采集并檢測(cè)36份，其中23份為陽(yáng)性結(jié)果，帶菌率為63.0%；果柄樣品共采集并檢測(cè)12份樣品，其中3份為陽(yáng)性結(jié)果，帶菌率為25.0%；樹皮樣品共采集并檢測(cè)45份，其中35份為陽(yáng)性結(jié)果，帶菌率為77.0%；根樣品共采集并檢測(cè)14份樣品，其中5份為陽(yáng)性結(jié)果，帶菌率為35.7%。

表2 田間樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 Source,quantity,infected rate of field samples

3 討 論

由于獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病具有擴(kuò)展快、危害重、防治難等特點(diǎn)，所以病原菌的早期診斷對(duì)病害的精準(zhǔn)防治尤為關(guān)鍵。因此，開發(fā)一種針對(duì)其病原菌的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法為病害侵染早期有效識(shí)別和及時(shí)防治至關(guān)重要。

相比于PCR檢測(cè)或qRT-PCR，LAMP檢測(cè)具有明顯優(yōu)勢(shì)，主要體現(xiàn)在：①特異性強(qiáng)，即反應(yīng)所需的內(nèi)外兩對(duì)引物基于目的基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)，檢測(cè)過程中必須與引物完全匹配才能擴(kuò)增；②靈敏度高，即該檢測(cè)方法靈敏度一般比PCR低10倍[9]，但通過引物篩選，反應(yīng)體系優(yōu)化等步驟可將檢測(cè)靈敏度提高。Duan等[10]在核盤菌高抗苯并咪唑菌株LAMP檢測(cè)方法的研究中，通過體系優(yōu)化，LAMP靈敏性比PCR高1 000倍；③設(shè)備簡(jiǎn)單，即不需要專業(yè)的PCR儀及電泳設(shè)備，因?yàn)長(zhǎng)AMP反應(yīng)是恒溫?cái)U(kuò)增，通過簡(jiǎn)單的水浴鍋或保溫杯等恒溫設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增；④反應(yīng)時(shí)間短，即LAMP反應(yīng)通常1 h內(nèi)可完成，本研究?jī)?yōu)化后的反應(yīng)體系可于30 min內(nèi)完成反應(yīng)，相比于PCR長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)過程及后續(xù)電泳結(jié)果判定，LAMP具有明顯的優(yōu)勢(shì)；⑤反應(yīng)結(jié)果可視化，即在理論上，LAMP檢測(cè)結(jié)果可通過觀察反應(yīng)擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂(白色沉淀)[11]直接判定結(jié)果。但通常情況下，并不會(huì)很容易觀察沉淀，所以可通過加入SYBR Green I[12]或者羥基萘酚藍(lán)(HNB)[6]等染料來使反應(yīng)結(jié)果呈現(xiàn)出可視化。

本研究參考國(guó)外獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病LAMP快速檢測(cè)方法，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行一定優(yōu)化。首先是降低成本，通過建立并優(yōu)化反應(yīng)體系，拋棄對(duì)試劑盒的依賴，降低檢測(cè)成本。然后通過使檢測(cè)結(jié)果的可視化，使檢測(cè)的結(jié)果判定不依賴于專業(yè)儀器，并且可以在反應(yīng)完成后直接觀察檢測(cè)結(jié)果，從而提高檢測(cè)效率。同時(shí)，檢測(cè)的靈敏性達(dá)到102CFU/mL，完全可以用于田間檢測(cè)。

田間檢測(cè)結(jié)果揭示獼猴桃不同的組織部位均可帶菌，且?guī)Ь瘦^高，其中樹皮中帶菌率高達(dá)77.0%。此結(jié)果提示：在田間防治獼猴桃潰瘍病時(shí)要全面噴防藥劑，同時(shí)要重點(diǎn)關(guān)注幼枝樹皮、葉片和花等部位的防治。

獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病嚴(yán)重威脅獼猴桃果樹的健康，阻礙中國(guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究結(jié)合以往國(guó)外獼猴桃檢測(cè)方法建立的經(jīng)驗(yàn)，通過對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化、反應(yīng)結(jié)果的可視化使LAMP檢測(cè)方法能夠得到更廣泛的應(yīng)用，本研究結(jié)果無論對(duì)獼猴桃的引種栽培還是獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的季節(jié)性精準(zhǔn)防治都具有借鑒作用。