李 晨，吳 楠 ，劉召陽 ，高宇琪，黃麗麗，馮 浩

(1.西北農林科技大學植物保護學院，陜西楊凌 712100; 2.旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

PCH(Pombe Cdc15homology)蛋白能夠通過連接細胞骨架元件與細胞膜參與很多生物學過程，如胞質分裂、囊泡運輸、胞吞胞吐等[1]。該類蛋白主要包括N末端的FCH(Fes/CIP homology,F-BAR)結構域和C末端的SH3(Src Homology3)結構域。其中，F(xiàn)CH結構域主要負責連接細胞膜和細胞骨架，促進膜彎曲，導致膜內陷或突出[2-6]。SH3結構域可以募集其他配體蛋白，維持收縮環(huán)的穩(wěn)定[7]。Imp2是PCH蛋白家族的成員之一，其F-BAR結構域在參與胞質分裂過程中，在收縮環(huán)收縮和分解中起到至關重要的作用[8]。目前研究表明，Imp2可以與兩個含有F-BAR結構域蛋白Cdc15和Rga7協(xié)同作用參與收縮環(huán)的組裝、收縮以及分解，以確保正常的胞質分裂[9]。Imp2的SH3結構域能夠與其配體通過特定的相互作用形成一個蛋白網(wǎng)絡穩(wěn)定收縮環(huán)。這種相互作用的破壞會改變蛋白質募集的時間和完整性，進而影響細胞分裂等活動[7]。Imp2的SH3結構域除維持收縮環(huán)的穩(wěn)定外，還能夠通過調節(jié)細胞高爾基體和液泡的功能參與真菌的膜轉運[10]。

蘋果樹腐爛病(AppleValsacanker)是由黑腐皮殼屬真菌Valsamali引起的重要枝干病害[11-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，蘋果樹腐爛病菌基因組中存在VmImp2，且該基因的表達受到病菌miRNA的調控，推測其在蘋果樹腐爛病菌的生長、繁殖及致病過程中發(fā)揮重要作用。為此，本試驗對VmImp2的功能進行研究，為進一步明確腐爛病菌的生長發(fā)育及致病的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試材料及載體 蘋果樹1 a生枝條采自陜西省咸陽市乾縣盤洲村富士蘋果(Malusdomesticaborkh cv.‘Fuji’)。蘋果樹腐爛病菌野生型菌株03-8培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基，由西北農林科技大學植物保護學院果樹病害綜合防控實驗室提供。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基，用于載體構建。pFL2質粒(含有抗G418的neo基因)以及pDL2質粒(含抗潮霉素的hph基因)，均由西北農林科技大學許金榮教授惠贈。

1.1.2 主要試劑 質粒小提試劑盒和PCR凝膠回收試劑盒均購于OMEGA公司；TaqDNA聚合酶購于康為試劑公司；Fast Pfu DNA聚合酶購于北京全式金生物科技有限公司；潮霉素及氨芐青霉素購于MP公司；裂解酶(Lysing Enzyme)及崩潰酶(Drisealase)購于Sigma公司；限制性內切酶購于Thermo公司；引物合成和測序由北京擎科生物技術有限公司完成。

1.2 VmImp2基因生信分析

通過NCBI網(wǎng)站下載VmImp2蛋白同源序列，用MEGA7軟件以極大似然法構建蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。同時用SMART軟件對Imp2蛋白序列進行初步分析。

1.3 基因組DNA提取

將活化好的野生型菌株03-8接種到鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上，25℃暗箱培養(yǎng)3 d后，使用百泰克真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取菌絲基因組DNA。將提取成功的菌絲DNA用分光光度法進行純度與濃度的檢測。

1.4 VmImp2基因敲除和Δ VmImp2突變體鑒定

參考蘋果樹腐爛病菌的全基因組數(shù)據(jù)[14]，用Premier 5.0軟件設計引物(表1)。引物1F/2R與3F/4R，分別擴增VmImp2基因的上下游片段(2 000 bp左右)。其中引物2R和3F的5′端帶有與neo同源序列。以質粒pFL2為模板，以NeoF和NeoR為引物擴增neo基因。同時設計巢式引物CF/CR。利用Double-joint PCR的方法構建敲除載體，詳細步驟參考Yu等[15]的方法。根據(jù)同源重組的原理，將構建好的敲除載體，通過PEG介導原生質體轉化的方法轉入配置好的原生質中。詳細步驟按照高靜等[16]的方法進行，利用含有125 μg/mL的G418培養(yǎng)基篩選陽性轉化子，并通過四對檢測引物5F/6R、G418F/G418R、7F/G418R、G418F/8R對候選突變體進行檢測。5F/6R引物用于檢測VmImp2基因是否存在，G418F/G418R引物用于檢測neo片段是否插入，7F/G418R引物和G418F/8R引物分別用于檢測VmImp2基因的上下游是否發(fā)生同源重組替換。

1.5 VmImp2基因回補及回補突變體鑒定

用Premier 5.0軟件設計回補引物HF/HR(表1)。以野生型菌株03-8基因組DNA為模板，擴增包含VmImp2基因上游1 500 bp(包含VmImp2基因啟動子序列)以及VmImp2基因全長的片段，通過XhoI酶切后，連接到含有潮霉素抗性的pDL2載體上。利用PEG介導原生質體轉化法，將構建成功的回補載體導入基因缺失突變體中，用含有100 μg/mL潮霉素的PDA平板篩選回補轉化子，并通過PCR檢測陽性轉 化子。

表1 本研究所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.6 表型分析

生長速率測定：分別將野生型菌株03-8與突變體接在PDA平板上，在25℃暗箱培養(yǎng)48 h后，觀察菌落生長形態(tài)，并用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值。每個菌株設置3個重復，試驗重復3次。

繁殖體形成分析：將野生型菌株及突變體菌株放置于25℃暗箱培養(yǎng)5 d后，轉移至25℃，光暗交替的條件下(即光照處理12 h/d，黑暗處理12 h/d)，繼續(xù)培養(yǎng)16 d，共培養(yǎng)21 d后觀察繁殖體產生情況。每個菌株設置3個重復，試驗重復3次。

致病力測定：參考韋潔玲等[17]的方法。將富士蘋果枝條清洗消毒后，燙傷法制造傷口，將活化好的缺失突變體和回補菌株分別接在枝條傷口處，以野生型03-8作為對照，25 ℃下保濕培養(yǎng)， 3 d后測量病斑大小并記錄數(shù)據(jù)。每組9根枝條，共3次重復試驗。

2 結果與分析

2.1 VmImp2基因編碼蛋白結構及進化分析

VmImp2共編碼1 487個氨基酸，含有3個結構域，分別為FCH結構域，SH3結構域和Seipin結構域(圖1)。FCH和SH3結構域是PCH蛋白家族的典型結構域，參與調節(jié)胞質分裂。利用MEGA7對VmImp2蛋白與其他真菌的Imp2同源蛋白構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示，蘋果腐爛病菌(V.mali)與黑腐皮殼屬 (V.spp.)，梨孢屬(Pyriculariaspp.)，炭疽菌屬(Colletotrichumspp.)的親緣關系較近，其中與梨腐爛病菌(V.pyri)親緣關系最近(98.11%)。

2.2 VmImp2基因的敲除和回補

為了闡明蘋果樹腐爛病菌中VmImp2基因的基本生物學功能，利用野生型菌株03-8進行VmImp2基因的敲除與回補。根據(jù)同源重組原理(圖2-A)，利用PEG介導的原生質體轉化體系，獲得大量轉化子。對這些轉化子用4對引物進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)VmImp2-11、VmImp2-12、VmImp2-70、VmImp2-104和VmImp2-166轉化子中5F/6R引物無法檢測到條帶；G418F/G418R引物能夠檢測到條帶；7F/G418R以及G418F/8R也能檢測到正確條帶(圖2-B)。說明敲除載體與VmImp2發(fā)生同源重組，替代了VmImp2在基因組的位置。同時，將構建成功的回補載體轉入缺失突變體VmImp2-70中，用檢測引物5F/6R對回補轉化子進行PCR檢測，結果顯示有3個轉化子能夠檢測到條帶，分別命名為VmImp2C-10、VmImp2C-26和VmImp2C-30(圖2-C)。

2.3 VmImp2對菌絲的營養(yǎng)生長的影響

為明確VmImp2對菌絲營養(yǎng)生長的影響，將野生型菌株03-8、缺失突變體菌株以及回補菌株分別放置在25℃黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)并測量菌株直徑。結果顯示，與野生型03-8相比，缺失突變體菌株的生長速率明顯下降，菌絲更加稀疏(圖3-A，3-B)?；匮a菌株與野生型相比無明顯變化(圖3-C，3-D)。

2.4 VmImp2對病菌繁殖體產生的影響

將菌株光暗培養(yǎng)21 d后觀察繁殖體產生情況并統(tǒng)計繁殖體數(shù)量。與野生型03-8相比，缺失突變體菌株繁殖體產生受到顯著影響，幾乎不能產生繁殖體(圖4-A)。野生型菌株平均繁殖體產生數(shù)量為144個，缺失突變體相較于野生型，繁殖體產生數(shù)量平均下降97%以上(圖4-B)，回補菌株的繁殖體產生情況基本恢復到野生型水平(圖4-C，4-D)。

2.5 VmImp2對病菌致病力的影響

為明確VmImp2敲除對病菌致病力的影響，分別將野生型03-8、VmImp2缺失突變體、回補菌株接種到蘋果枝條上，3 d后觀察侵染情況并測量病斑大小。野生型03-8病斑平均直徑為 31.36 mm，VmImp2缺失突變體致病力比野生型致病力平均下降93%以上(圖5-A，5-B)。回補菌株平均病斑直徑為30.1 mm，致病力基本恢復到野生型水平(圖5-C，5-D)。

3 結論與討論

細胞分裂過程是真菌進行無性繁殖的重要方式，對于真菌的形態(tài)建成至關重要。在真菌中，胞質分裂以及隔膜形成需要肌動蛋白環(huán)的收縮和隔膜組裝[18]。有研究[19]表明，Imp2蛋白在參與細胞分裂過程中有重要作用。在裂殖酵母中，Imp2蛋白在分裂后期調控收縮環(huán)的收縮與分解。當Imp2蛋白被敲除后，在細胞分裂過程中，收縮環(huán)不能正常的工作與分解，影響細胞的正常生長[8，19]。本研究發(fā)現(xiàn)，當蘋果腐爛病菌的Imp2蛋白被敲除后，缺失突變體的營養(yǎng)生長的確受到較大影響，但并沒有完全停止生長。這可能是因為在收縮環(huán)上不止有Imp2一個蛋白在行使分裂功能。在裂殖酵母中，目前已經發(fā)現(xiàn)Imp2、Cdc15與Rga7三種PCH蛋白家族成員共同參與收縮環(huán)的組裝、收縮以及分解過程，在功能上有一定冗余[9，20]。然而，與Imp2同屬一個蛋白家族的Cdc15與Rga7，雖然能夠對Imp2的功能進行補償，但是，它們在細胞周期中的功能還存在一定差異[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，與菌絲營養(yǎng)生長相比，缺失突變體菌株幾乎喪失產生繁殖體的能力。蘋果樹腐爛病菌的分生孢子是有隔膜的鏈狀分枝[21]，缺失突變體菌株會影響正常的胞質分裂，進而影響分生孢子隔膜形成，使缺失突變體產生繁殖體的能力喪失。也說明相對于對營養(yǎng)生長階段菌絲分裂的影響，Imp2可能對病菌繁殖體的正常產生影響更大。

致病力分析發(fā)現(xiàn)，與野生型03-8相比，缺失突變體菌株對枝條的侵染能力基本喪失。一方面是因為缺失Imp2蛋白影響菌絲的正常分裂生長，造成致病力下降。另一方面也可能是因為Imp2的SH3能夠參與真菌的膜轉運[10]。缺失Imp2蛋白后，病菌產生的致病因子果膠酶，毒素等[22-25]大量致病因子分泌受到阻礙，降低對蘋果枝條的致病力。

目前，對于Imp2蛋白的研究多集中在裂殖酵母中，并且主要研究Imp2蛋白對細胞分裂進程的影響。與前人研究Imp2蛋白的生理功能相比，本研究首次明確蘋果樹腐爛病菌分隔蛋白基因VmImp2不僅能夠影響菌絲的營養(yǎng)生長以及繁殖體形成外，還參與病菌的致病過程，能夠顯著降低病菌的致病力，為進一步明確腐爛病菌的生長發(fā)育及致病機理奠定基礎。