亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        紫色紅曲霉磁受體IscA1的基因克隆及功能分析

        2021-06-28 07:42:00黃勝男劉應(yīng)保張佳蘭高夢(mèng)祥
        關(guān)鍵詞:磁感應(yīng)紫色測(cè)序

        黃勝男,劉應(yīng)保,張佳蘭,高夢(mèng)祥

        (長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州 434025)

        磁場(chǎng)在保護(hù)地球免遭高能宇宙射線的損傷方面至關(guān)重要[1],同時(shí),還能顯著調(diào)節(jié)地球生物的生長(zhǎng)和代謝[1-3],即磁致生物學(xué)效應(yīng)。過(guò)去的幾十年,大量的研究報(bào)道了動(dòng)物、微生物等生物中存在磁場(chǎng)生物學(xué)效應(yīng)[3-7]。然而,關(guān)于生物的磁感應(yīng)機(jī)制的研究相對(duì)較少。

        目前,主流的生物磁感應(yīng)機(jī)制主要包括磁顆粒介導(dǎo)磁感應(yīng)假說(shuō)和隱花色素(cryptochrome,CRY)的化學(xué)自由基對(duì)磁感應(yīng)假說(shuō)[1-2]。前者認(rèn)為生物磁感應(yīng)主要由特定細(xì)胞中微小磁顆粒簇(Fe3O4等)介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的,比如趨磁細(xì)菌的磁小體,而且該裝置在基因組上有特定的基因編碼區(qū),比如磁小體島。在高等生物中,雖然發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的磁顆粒,但是一直未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的編碼基因。隨后,隱花色素CRY的化學(xué)自由基對(duì)磁感應(yīng)的假說(shuō)被提出。該假說(shuō)基于藍(lán)光受體CRY蛋白與輔因子FAD通過(guò)光誘導(dǎo)的自由基響應(yīng)磁感應(yīng)。大量的研究結(jié)果支持該假說(shuō)。近10多年來(lái),本課題組以絲狀真菌為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)了磁場(chǎng)的各種生物學(xué)效應(yīng)[8-15 ]。同時(shí),通過(guò)分子生物學(xué)手段結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué),重點(diǎn)研究了藥食兩用的絲狀真菌紫色紅曲霉的磁感應(yīng)機(jī)制。然而在大量差異表達(dá)蛋白中,未發(fā)現(xiàn)上述磁感應(yīng)假說(shuō)中的磁顆粒和CRY及其相關(guān)蛋白[16],而是發(fā)現(xiàn)其他蛋白,比如最關(guān)鍵的是鐵硫簇(iron sulfur cluster,ISC/Fe-S cluster)生物合成系統(tǒng)中的成員蛋白Isu1、IscS、IscA1、 Grx5等。其中,IscA1是最近在果蠅(Drosophilamelanogaster)中發(fā)現(xiàn)的新的磁受體MagR[17]。IscA1在不同生物中高度保守,除了作為磁受體,該蛋白還在能量代謝、輔因子、鐵硫儲(chǔ)備、基因表達(dá)調(diào)控等過(guò)程發(fā)揮重要作用[1]。最近,Zhou等[18]在紅色紅曲霉(MonascusruberM7)中克隆了IscA1基因,被認(rèn)為是該菌的候選磁受體基因。由此推測(cè), IscA1可能是紫色紅曲霉中的磁受體蛋白,該蛋白也是介導(dǎo)該菌磁感應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白。基于此,本研究采用同源克隆方法,經(jīng)PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序獲得紫色紅曲霉的磁受體基因IscA1的編碼序列,并借助生物信息學(xué)工具初步揭示其生物學(xué)功能。

        1 材料與方法

        1.1 菌種和引物

        所用菌種為紫色紅曲霉(MonascuspurpureusSKY219),為長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。所用引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成,具體序列見(jiàn)表1。

        表1 所用引物Table 1 Primers used in this study

        1.2 主要試劑和儀器

        DL5000 DNA Marker(MD102-02),DL2000 DNA Marker(MD101-02),2 × Phanta Master Mix(P511-01),DNA純化試劑盒(DC301-1),總RNA提取試劑(RNA isolater Total RNA Extraction Reagent,R401-01),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR,R223-1)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide,CTAB),氯仿,無(wú)水乙醇,異丙醇,苯酚購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        ZF-208凝膠成像系統(tǒng)為上海嘉鵬科技有限公司產(chǎn)品;C1000 TouchTM型PCR儀,PowerPac Basic型電泳儀,GelDocTM XR型凝膠成像儀為美國(guó)Bio-rad公司產(chǎn)品。

        1.3 方法

        1.3.1 紫色紅曲霉(M.purpureusSKY219)磁受體IscA1基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì) 根據(jù)近緣種紫色紅曲霉(M.purpureusNRRL 1596)的IscA1基因序列(Monpu1_501839)[18]設(shè)計(jì)引物(表1),擴(kuò)增本研究所用紫色紅曲霉(M.purpureusSKY219)中IscA1的DNA和編碼區(qū)序列,預(yù)期擴(kuò)增的長(zhǎng)度分別為1 331和735 bp。

        1.3.2IscA1的DNA擴(kuò)增 基因組提取參照文獻(xiàn)[14]方法。以M.purpureusSKY219基因組為模板,擴(kuò)增IscA1的DNA序列。PCR反應(yīng)體系為:基因組模板為1 μg,引物(IscA1F1/IscA1R1)各2 μL,2 × Phanta Master Mix 25 μL,用去離子水補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s、50 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s,30個(gè)循環(huán); 72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并對(duì)目的DNA片段純化,然后送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行DNA 測(cè)序。

        1.3.3IscA1的cDNA擴(kuò)增 首先提取M.purpureusSKY219的總RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增IscA1的編碼區(qū)序列??俁NA提取方法如下:收集培養(yǎng)6 d的菌體,在液氮預(yù)冷的研缽中速凍并充分研磨后,取適量的粉末放于含1 mL RNA提取試劑的1.5 mL無(wú)酶離心管中,充分混勻后,加入1/5體積的氯仿,混勻,靜置5 min,4 ℃、10 000 r/min離心10 min,取上清加入等體積預(yù)冷的異丙醇沉淀30 min,離心 10 min,棄上清,沉淀用75%乙醇洗滌兩次,離心 10 min,棄上清,沉淀晾干,用DEPC水溶解,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。得到總RNA之后,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。接著以cDNA為模板擴(kuò)增IscA1的編碼區(qū),反應(yīng)體系為:cDNA 1 μg,引物各2 μL,2 × Phanta Master Mix 25 μL,用去離子水補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán), 72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,純化目的DNA,并進(jìn)行DNA測(cè)序。

        1.3.4IscA1的生物信息學(xué)分析 將IscA1的編碼序列進(jìn)行多序列對(duì)位排列分析搜索其保守結(jié)構(gòu)域,并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù);預(yù)測(cè)其蛋白一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)等,具體工具和使用方法見(jiàn)表2。

        表2 所用到的分析工具和方法Table 2 Analysis tools and methods used in this study

        2 結(jié)果與分析

        2.1 IscA1的DNA擴(kuò)增

        根據(jù)紫色紅曲霉近緣種的IscA1基因設(shè)計(jì)引物,以M.purpureusSKY219基因組(圖1-a)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果(圖1-b)顯示,在電泳膠的第2泳道的1 500 bp附近有1條特異性條帶,與IscA1的預(yù)期的DNA序列大小(1 331 bp)相符,即目的DNA擴(kuò)增成功。DNA測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),M.purpureusSKY219的IscA1基因的DNA序列與M.purpureusNRRL 1596的IscA1的基因序列的相似度為100%(覆蓋度為100%),即兩者IscA1的DNA序列完全相同。

        2.2 IscA1的cDNA擴(kuò)增

        以M.purpureusSKY219的總RNA(圖2-a)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示(圖2-b),在第2泳道上,750 bp附近有1條特異性條帶,與預(yù)期大小(735 bp)相符。IscA1編碼區(qū)測(cè)序與M.purpureusNRRL 1596的IscA1的編碼區(qū)完全相同,該序列經(jīng)NCBI ORFfinder分析發(fā)現(xiàn),IscA1共編碼244氨基酸(圖3)。

        2.3 IscA1保守結(jié)構(gòu)域和蛋白家族歸屬分析

        將M.purpureusSKY219的 IscA1與腹黑果蠅(D.melanogaster)、紅色紅曲霉(M.ruber)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、原鴿(Columbalivia)、斑馬魚(yú)(Daniorerio)、秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)、擬南芥(Arabidopsiathaliana)、大豆(Glycinemax)等物種的 IscA1進(jìn)行多序列對(duì)位排列分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),M.purpureusSKY219的 IscA1與其他物種的磁受體蛋白在序列上高度相似,尤其是第172、236和238位的半胱氨酸Cys(C,星號(hào)“*”標(biāo)識(shí))最為保守,為鐵硫簇結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。

        在線工具Batch CD-Search搜索保守結(jié)構(gòu)域的結(jié)果發(fā)現(xiàn),M.purpureusSKY219的 IscA1與其他物種的磁受體蛋白都具有典型的Fe-S簇生物合成超家族(TIGR00049)結(jié)構(gòu)域(圖5)。

        上述蛋白構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)圖顯示,M.purpureusSKY219的 IscA1與M.ruber、S.cerevisiae真菌的磁受體 IscA1聚在一個(gè)進(jìn)化枝上,同時(shí)與細(xì)菌和植物聚在另一個(gè)大的進(jìn)化枝上(圖6)。

        2.4 IscA1的理化性質(zhì)分析

        ProParam分析的結(jié)果表明, IscA1為堿性蛋白(pI為10.05),分子質(zhì)量為27 106 u,不穩(wěn)定系數(shù)為59.99(>40),為不穩(wěn)定蛋白。其中絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)和丙氨酸(Ala)含量最為豐富,分別占比為12.3%、9.0%和8.2%。親水性指數(shù)為負(fù)值(-0.575),即為親水蛋白。

        2.5 IscA1的親疏水性預(yù)測(cè)

        Protscale的親疏水性分析發(fā)現(xiàn),IscA1蛋白的絕大部分氨基酸的親水性數(shù)值均為負(fù)值(圖7),與上述理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果一致,即為親水 蛋白。

        2.6 IscA1的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

        二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),IscA1的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈的比例分別為22.13%、2.05%、62.70%、13.11%,以無(wú)規(guī)則卷曲為主(圖8)。

        2.7 IscA1的磷酸化修飾預(yù)測(cè)

        Netphos 3.1預(yù)測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),IscA1在Ser、Thr和Tyr3個(gè)位點(diǎn)被磷酸化修飾的個(gè)數(shù)分別為26、21、13個(gè)(圖9)。表明紫色紅曲霉中的IscA1可能被其他激酶磷酸化修飾。

        2.8 IscA1的三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬

        軟件SWISS-MODEL模擬的IscA1的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖10所示。IscA1以細(xì)長(zhǎng)嗜熱聚球藻(ThermosynechococcuselongatusBP-1)為模板,二者的相似度為37%,覆蓋度為43%。模擬結(jié)果顯示,三維結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊為主,還有比較典型的α-螺旋(圖10)。

        2.9 IscA1的亞細(xì)胞定位分析

        Predict Protein預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示,IscA1主要定位于線粒體(圖11)。同時(shí)WoLF PSORT預(yù)測(cè)的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),IscA1也是定位于線粒體,二者預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

        2.10 IscA1的互作蛋白預(yù)測(cè)

        String預(yù)測(cè)的互作蛋白的結(jié)果顯示(圖12),IscA1可以與Fe-S簇裝配輔助蛋白IscA2(ANIA_05953)和谷氧還蛋白Grx 5(AN4304.2)發(fā)生非特異性結(jié)合。而且,IscA1和Grx可以被分子伴侶DnaJ蛋白激活(AN4304.2)。Grx 5、DnaJ和IscA1共同參與Fe-S簇的生物合成和傳遞過(guò)程,因此,在Fe-S簇組裝和傳遞過(guò)程中會(huì)發(fā)生不同的互作[18]。PPA-Pred預(yù)測(cè)的蛋白間親和力的結(jié)果顯示,IscA1與D.melanogaster的藍(lán)光受體蛋白CRY之間的親和力較強(qiáng)(自由能△G=-45.99 kJ/mol,解離常數(shù)Kd=1.03e-8mol),而與絲狀真菌構(gòu)巢曲霉的藍(lán)光受體LreA、LreB均有更強(qiáng)的親和力(IscA1/LreA:△G= -55.52 kJ/mol,Kd=1.9e-10mol;IscA1/LreB:△G=-42.91 kJ/mol,Kd=3.04e-8mol),這些結(jié)果說(shuō)明磁受體IscA1與不同的藍(lán)光受體蛋白(CRY、LreA、LreB)均可以互作,與新近報(bào)道的磁受體IscA1-藍(lán)光受體CRY復(fù)合物共同感應(yīng)磁場(chǎng)的理論相符[16]。

        3 結(jié)論與討論

        IscA1是Fe-S簇生物合成系統(tǒng)中的必需蛋白,在各個(gè)物種中高度保守[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),該蛋白是紫色紅曲霉磁感應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白。最新的研究揭示,IscA1是新的磁受體[16]。因此,本研究基于同源克隆原理,通過(guò)PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序,獲得M.purpureusSKY219的IscA1編碼區(qū)序列,該基因編碼的蛋白共有244個(gè)氨基酸。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),IscA1與真菌的同源蛋白親緣關(guān)系較近。該蛋白具有3個(gè)最保守的Cys(172、236和238位),并具有典型的Fe-S簇生物合成超家族的保守結(jié)構(gòu)域,這些都是已報(bào)道的磁受體IscA1的典型特征[1]。IscA1為堿性蛋白和親水蛋白,二級(jí)結(jié)構(gòu)組成與已報(bào)道的M.ruberM7的IscA1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似[18],均以不規(guī)則卷曲為主,其次是α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角。模擬的IscA1三級(jí)結(jié)構(gòu)則與解析的T.elongatus的IscA1的晶體結(jié)構(gòu)具有較高的相似度,具有典型的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角[19]。IscA1具有60個(gè)可能的磷酸化修飾位點(diǎn),主要定位于線粒體。蛋白互作的結(jié)果發(fā)現(xiàn),IscA1可被DnaJ激活,并和IscA2、Grx5存在互作關(guān)系。在線粒體Fe-S簇生物合成過(guò)程中,F(xiàn)e2+和S原子在支架蛋白IscU上組裝成初生的[2Fe-2S]簇,然后在DnaJ、HSP等蛋白的協(xié)助下,將簇傳遞給載體Grx5,然后在IscA1、IscA、IBA57等蛋白復(fù)合物的幫助下,將Fe-S “交付”給脫輔基蛋白[19-20]。因此,在Fe-S的組裝和傳遞過(guò)程中,IscA1會(huì)和上述蛋白發(fā)生相互作用。最新的研究提出,磁受體IscA1和藍(lán)光受體CRY形成蛋白復(fù)合物賦予果蠅等生物磁感應(yīng)能力[17],本研究也發(fā)現(xiàn),IscA1與不同藍(lán)光受體(CRY、LreA、LreB)之間均存在較強(qiáng)的親和力,表明IscA1在紫色紅曲霉中可能與未知的藍(lán)光受體蛋白形成復(fù)合物賦予該菌磁感應(yīng)能力。研究結(jié)果為全面揭示磁受體IscA1在紫色紅曲霉磁感應(yīng)機(jī)制中的功能奠定基礎(chǔ)。

        猜你喜歡
        磁感應(yīng)紫色測(cè)序
        跨空海界面磁感應(yīng)通信特性分析及應(yīng)用
        杰 Sir 帶你認(rèn)識(shí)宏基因二代測(cè)序(mNGS)
        新民周刊(2022年27期)2022-08-01 07:04:49
        電磁感應(yīng)中的“知三求三”
        紫色風(fēng)鈴
        二代測(cè)序協(xié)助診斷AIDS合并馬爾尼菲籃狀菌腦膜炎1例
        傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:58
        論《紫色》中的兩性和諧
        基因捕獲測(cè)序診斷血癌
        單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展
        永磁魔環(huán)磁感應(yīng)強(qiáng)度的仿真模擬
        物理與工程(2013年3期)2013-03-11 16:04:35
        浪漫紫色
        欧洲熟妇色xxxx欧美老妇多毛图片| 日韩精品一区二区在线视| 国产性感午夜天堂av| 久久精品国产字幕高潮| 纯爱无遮挡h肉动漫在线播放| 国产福利片无码区在线观看 | 国产a级精精彩大片免费看| av男人的天堂手机免费网站| 国产精品一区二区三区专区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品| 真正免费一级毛片在线播放| 亚洲天堂免费一二三四区| 国产精品熟女一区二区三区| 国产精品泄火熟女| 亚洲av无码成人yellow| 亚洲综合精品在线观看中文字幕| 丰满的少妇av一区二区三区| 被黑人猛烈30分钟视频| 亚洲综合色一区二区三区另类| 极品视频一区二区三区在线观看| 国产一区二区视频在线免费观看| 护士人妻hd中文字幕| 久久久久亚洲精品美女| 国产精品亚洲av一区二区三区| www夜插内射视频网站| 激情内射亚州一区二区三区爱妻| 日本特黄a级高清免费大片| 日韩一区二区中文天堂| 中国少妇×xxxx性裸交| 免费黄色电影在线观看| 巨臀精品无码AV在线播放| 国产三级精品三级在线专区2| 中文无码一区二区不卡av| 欧美日韩国产专区| 日本高清在线一区二区三区| 亚洲国产精品无码aaa片| www插插插无码免费视频网站| 巨臀精品无码AV在线播放| 少妇被黑人嗷嗷大叫视频| 女人被狂c躁到高潮视频| 亚洲午夜福利精品久久|