趙 愛(ài) 張 麗 孟 琳

1.江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科，江蘇淮安 223300；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，江蘇徐州 221000

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)被定義為兩個(gè)或多個(gè)連續(xù)妊娠失敗，影響1%～3%育齡婦女[1-4]。亞甲基四氫葉酸還原酶在葉酸代謝中起著至關(guān)重要的作用[5-7]。研究認(rèn)為，MTHFR基因突變可導(dǎo)致葉酸代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)異常，從而導(dǎo)致妊娠失敗，是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病的重要原因之一[8-10]。同型半胱氨酸水平異常是血液高凝狀態(tài)的重要因素，同型半胱氨酸水平增加可導(dǎo)致血液高凝，是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要病因[11]。MTHFR 酶在葉酸、高半胱氨酸的代謝中起著核心作用[12-13]。本研究旨在觀察MTHFR 基因C677T及A1298C 多態(tài)性與血漿同型半胱氨酸在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年12 月—2019 年6 月江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院收治的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性100 例為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組。選取標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>20 歲且<40 歲；②診斷標(biāo)準(zhǔn)符合皇家婦產(chǎn)科學(xué)院（RCOG）中不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)指南[14]；③簽署知情同意書(shū)；④流產(chǎn)次數(shù)≥2 次。排除標(biāo)準(zhǔn)：①夫妻雙方染色體核型異常；②抗磷脂抗體陽(yáng)性；③多胎妊娠；④宮頸功能不全、輔助生殖技術(shù)妊娠、輸卵管疾病、生殖器器質(zhì)性病變、先兆子癇史、系統(tǒng)性自身免疫疾??；⑤神經(jīng)精神疾病、吸煙史、糖尿病、骨質(zhì)疏松、甲狀腺功能異常、腫瘤、肝功能障礙；⑥近期服用葉酸、維生素B12、維生素B6、核黃素等；⑦因胎兒染色體異常引起的流產(chǎn)。選取同期100 名有1 次生育史但無(wú)不良孕產(chǎn)史女性作為對(duì)照組。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組年齡21～39 歲，平均（33.1±3.3）歲；盆腔手術(shù)史15 例；體重指數(shù)（2.34±0.81）kg/m2。對(duì)照組年齡21～38 歲，平均（33.3±3.4）歲；盆腔手術(shù)史16 例；體重指數(shù)（2.36±0.82）kg/m2。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05），具有可比性。本研究符合《赫爾辛基宣言》中道德準(zhǔn)則。

1.2 方法

1.2.1 MTHFR 基因C677T 和A1298C 基因型檢測(cè)抽取約3 mL 靜脈血，置于EDTA 試管，使用DNA 提取試劑盒（貝克曼AMPure XPdna 提取試劑盒，貨號(hào)：A63880）提取總DNA。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性用于檢測(cè)基因型。PCR 反應(yīng)體系以23 μL 反應(yīng)進(jìn)行，含有0.25 μL Taq DNA 聚合酶混合物、0.2 μL dNTP、引物0.25 μL 1×Taq 緩沖液、1.5 μL MgCl2、2 μL 基因組DNA。PCR 反應(yīng)在35℃下進(jìn)行，共35 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件：95℃變性1 min，65℃退火30 s，72℃擴(kuò)展1 min，延伸周期72℃5 min。C677T 引物序列：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’（正向引物）、5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’（反向引物）。A1298C引物序列：5’-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3’（正向引物）和5’-CACTTTGTGACCGTTCCGGTTTG-3’（反向引物）。使用DNA 測(cè)序儀（德國(guó)Roche 公司）進(jìn)行基因型檢測(cè)[15]。

1.2.2 血漿同型半胱氨酸檢測(cè) 抽取約3 mL 靜脈血，置于EDTA 試管，靜置30 min 后3000 r/min 離心8～10 min（離心半徑15 cm），取上清液，使用比色法測(cè)定同型半胱氨酸水平，試劑盒購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司，貨號(hào)：YBE031。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。使用Genemapping v.4.2 軟件評(píng)估基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg 平衡標(biāo)準(zhǔn)；復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與基因型的關(guān)系采用logistic 回歸分析。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組MTHFR 基因C677T 和A1298C 基因型分布

MTHFR 基因C677T 和A1298C 基因型頻數(shù)分布均符合Hardy-Weinberg 定律（對(duì)照組：C677T χ2=0.694，P=0.405；A1298C χ2=0.146，P=0.702。觀察組：C677T χ2=0.588，P=0.443；A1298C χ2=0.634，P=0.426）。兩組C677T 和A1298C 基因型比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組MTHFR 基因C677T 和A1298C 基因型分布[例（%）]

2.2 不同基因型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)

以復(fù)發(fā)性流產(chǎn)為因變量，以MTHFR 基因C677T和A1298C 基因型為自變量，賦值如下：C677T（CC=0，CT=1，TT=2）；A1298C（AA=0，AC=1，CC=2）。與C677T CC 型比較，C677T TT 型發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增加3.357 倍（P=0.008）；與A1298C AA 型，A1298C CC 型發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增加3.721 倍（P=0.012）。見(jiàn)表2。

表2 MTHFR 基因C677T 和A1298C 基因型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)

2.2 兩組血漿同型半胱氨酸水平比較

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組同型半胱氨酸水平為（8.98±2.11）μmol/L，高于對(duì)照組的（7.18±1.65）μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.720，P ＜0.001）。

2.3 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組不同基因型患者血漿同型半胱氨酸水平比較

C677T TT 型同型半胱氨酸水平高于C677T CC 型和C677T CT 型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）；A1298C CC 同型半胱氨酸水平高于A1298C AA 型和A1298C AC 型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組不同基因型患者血漿同型半胱氨酸水平比較

3 討論

MTHFR 基因多態(tài)性已被證實(shí)與流產(chǎn)有顯著相關(guān)性[16-19]，其中C677T 和A1298C 位點(diǎn)的研究較多[20]，既往研究證實(shí)，在不同國(guó)家和地區(qū)C677T TT 型和A1298C CC 型女性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)增高[21-23]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性C677T TT 型和A1298C CC 型占比高于對(duì)照組。與C677T CC 型比較，C677T TT 型發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增加3.357 倍（P=0.008）；與A1298C AA 型，A1298C CC 型發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增加3.721 倍（P=0.012）。該結(jié)果證實(shí)MTHFR 基因C677T 和A1298C 位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)造成影響，其中C677T TT 型和A1298C CC型女性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。

高同型半胱氨酸血癥導(dǎo)致流產(chǎn)的機(jī)制仍不清楚。高同型半胱氨酸血癥可能通過(guò)損傷內(nèi)皮細(xì)胞、激活血小板等誘導(dǎo)凝血而引發(fā)血栓形成，另一種機(jī)制可能是通過(guò)置換內(nèi)皮細(xì)胞以及調(diào)節(jié)和產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化蛋白-1 和白細(xì)胞介素-8 引起血管舒張，還有研究認(rèn)為其可通過(guò)氧化應(yīng)激直接對(duì)胚胎產(chǎn)生毒性作用[15,19]。王連等[15]研究認(rèn)為，高同型半胱氨酸血癥是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要危險(xiǎn)因素。MTHFR C677T 和A1298C 多態(tài)性、高同型半胱氨酸血癥和反復(fù)流產(chǎn)之間的關(guān)聯(lián)仍不清楚。本研究結(jié)果顯示，C677T TT 型同型半胱氨酸水平高于CC 型和CT 型；A1298C CC 型同型半胱氨酸水平高于AA 型和AC 型（均P ＜0.05）。提示C677T TT型、A1298C CC 型等位基因會(huì)增加同型半胱氨酸水平。Zaric 等[24]研究顯示，MTHFR 活性降低與高半胱氨酸水平顯著相關(guān)。C677T 和A1298C 突變可導(dǎo)致MTHFR酶活性受到抑制，使5-甲基四氫葉酸生成減少，因此5-甲基四氫葉酸與半胱氨酸生成蛋氨酸和四氫葉酸減少，從而導(dǎo)致核酸代謝障礙，胎兒生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制[25]。

綜上，MTHFR 基因C677T TT 型、A1298C CC 型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高，且C677T 及A1298C 多態(tài)性可導(dǎo)致同型半胱氨酸水平升高。MTHFR 基因C677T 及A1298C 突變可能通過(guò)改變酶活性增高同型半胱氨酸水平，參與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病。