關(guān)媛月 高玉雪 莊 園 陳德喜 王延軍

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院北京市肝病研究所，北京 100069

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種以體液和血液傳播為主的嗜肝DNA 病毒[1]，HBV 持續(xù)感染所致的肝癌是影響全球的一個(gè)重大健康問題，全世界至少超過3.5 億是慢性HBV 的感染者[2]，每年有約887 000 人死于HBV 相關(guān)的肝病。盡管已證實(shí)核苷（核苷酸）類似物（NAs）和聚乙二醇化干擾素-α（Peg-IFNα）可有效抑制HBV 復(fù)制，但NAs 需要長(zhǎng)期服用，α 干擾素（IFNα）治療則易產(chǎn)生各種副作用，且這兩種藥物均難以根除HBV，實(shí)現(xiàn)慢乙肝的臨床治愈[3]。因此，研究HBV 感染相關(guān)特異性蛋白標(biāo)志物，尋找新的藥物治療靶點(diǎn)，對(duì)于臨床具有重要的意義和價(jià)值。本研究使用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isotope tagging for relative and absolute protein quantitation，iTRAQ）技術(shù)對(duì)穩(wěn)定表達(dá)HBV 的HepG2.2.15 細(xì)胞株及其親本HepG2 細(xì)胞株進(jìn)行鑒定和定量分析，篩選出差異蛋白，通過生物信息學(xué)分析差異蛋白功能及相應(yīng)通路，為進(jìn)一步探討HBV 致病的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

HepG2 和HepG2.2.15 的肝癌細(xì)胞系于北京市肝病研究所保存。

1.2 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀（Nano，HPLC）、Durashell-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，EASY-Spray column）、質(zhì)譜系統(tǒng)（Orbitrap Fusion）和蛋白定量染液（23238）購自美國Thermo 公司；超聲波細(xì)胞破碎儀（XO）購自南京先歐儀器公司；硫脲（T7875）購自美國Sigma 公司；尿素（161-0731）購自美國Bio-Rad 公司；iTRAQ?試劑盒（4381664）和iTRAQ Reagent 8 Plex（4381663）購自美國AB Sciex 公司；DMEM 培養(yǎng)基（2003938）和胎牛血清（F8318）購自美國Sigma 公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行兩種肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)，2～3 d 進(jìn)行1 次傳代，放置到含有5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞蛋白質(zhì)譜分析

1.4.1 細(xì)胞收集 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照細(xì)胞傳代的方法進(jìn)行消化和計(jì)數(shù)，確保細(xì)胞數(shù)達(dá)到1×107個(gè)/mL 以上，將細(xì)胞沉淀放置到-80℃的冰箱備用。

1.4.2 細(xì)胞蛋白提取和定量 細(xì)胞中加入裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲）混勻，用超聲細(xì)胞破碎儀超聲60 s后室溫提取30 min，然后15 000 r/min（離心半徑為13.5 cm），4℃離心20 min，收集上清分裝凍存于-80℃；使用常規(guī)的蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行總蛋白的定量。

1.4.3 細(xì)胞蛋白酶解和iTRAQ 標(biāo)記 取100 μg 蛋白溶液置于離心管中，使用iTRAQ?酶解試劑盒進(jìn)行酶解，得到100 μL 酶解后的樣品；使用iTRAQ Reagent 8 Plex 進(jìn)行標(biāo)記，混合標(biāo)記后的樣品，離心并真空冷凍干燥后保存待用。

1.4.4 酶解產(chǎn)物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析 取標(biāo)記產(chǎn)物10 μL 進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用RIGOL L-3000 高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離，分離后用高效液相色譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.5 差異蛋白的分類及其功能分析

使用Uniprot-human 數(shù)據(jù)庫中的蛋白GO 注釋，鑒定所得差異蛋白最可能的生物學(xué)過程（biological process）、細(xì)胞學(xué)組分（cellular components）及分子功能（molecular function）屬性；使用京都基因與基因組百科全書（KEGG），數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析差異蛋白的富集通路、相互關(guān)系以及可能處于的功能群。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用Thermo 公司的配套商用軟件Proteome Discoverer 2.1 進(jìn)行結(jié)果分析。兩組細(xì)胞間蛋白差異分析采用t 檢驗(yàn)，兩組間蛋白差異倍數(shù)≥1.2 及P ＜0.05 的蛋白被認(rèn)為是差異蛋白。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異蛋白的篩選

利用Proteome Discoverer 2.1 軟件，共檢測(cè)出5394 個(gè)蛋白，按照上述差異蛋白判斷標(biāo)準(zhǔn)共篩選出856 個(gè)差異蛋白，其中上調(diào)的蛋白497 個(gè)，下調(diào)蛋白359 個(gè)，見圖1。并將前20 個(gè)最有顯著差異的蛋白質(zhì)列出。見表1。

2.2 差異蛋白的GO 分析

對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO 分析，分別富集到20 條生物學(xué)過程術(shù)語、12 條細(xì)胞組分術(shù)語和6 條分子功能術(shù)語，其主要影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)運(yùn)和囊泡介導(dǎo)的運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)過程。見圖2。

圖2 差異蛋白的GO 功能分類分布圖

2.3 差異蛋白的KEGG 分析

對(duì)差異蛋白進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，HBV表達(dá)后涉及的信號(hào)通路有藥物代謝、化學(xué)致癌、細(xì)胞色素P450 代謝異物以及MAPK 信號(hào)通路等。見圖3。

圖3 差異蛋白的KEGG 通路富集分析

2.4 差異蛋白的相互作用分析

對(duì)差異蛋白間的相互作用進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，多種蛋白之間具有相互關(guān)系，如SCF（是一種重要的造血干細(xì)胞生成因子）可與PROM1 和CD166 相互作用，深色節(jié)點(diǎn)代表上調(diào)，淺色節(jié)點(diǎn)代表下調(diào)。見圖4。

圖4 差異蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

慢性HBV 感染不僅導(dǎo)致致命的肝臟疾?。ㄈ绺斡不透嗡ソ撸沂垢伟┑娘L(fēng)險(xiǎn)大大增加，了解HBV 復(fù)制和感染的發(fā)病機(jī)制有利于改善患者篩查和治療方案，也可以為藥物和疫苗開發(fā)提供新途徑。本研究利用iTRAQ 技術(shù)篩選了穩(wěn)定表達(dá)HBV 的HepG2.2.15和親代HepG2 細(xì)胞株之間差異蛋白，共鑒定出856 個(gè)顯著差異的蛋白，對(duì)所有顯著差異蛋白做了GO 聚類分析及功能富集分析，試圖挖掘在穩(wěn)定表達(dá)HBV 肝癌細(xì)胞中有意義的蛋白，為進(jìn)一步了解HBV 病毒感染、復(fù)制及發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

微管相關(guān)蛋白1S（microtubule-associated proteins 1S，MAP1S）作為一種差異蛋白在HepG2.2.15 細(xì)胞株中顯著上調(diào)。MAP1S 是一種微管相關(guān)的自噬激活劑，可以通過微管依賴性和非依賴性方式影響自噬[4-6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)MAP1S 也可以通過維持Bcl-2 和P27 的水平，通過LKB1-AMPK-mTOR 通路抑制二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌；天然成分亞精胺也能夠通過激活MAP1S介導(dǎo)的自噬來延長(zhǎng)壽命，防止肝纖維化和肝癌的發(fā)生[8]。MAP1S 調(diào)控的自噬缺陷也可能會(huì)影響心臟病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病和一系列其他疾病[9-13]，但MAP1S 在HBV 所致肝癌中的作用還需要進(jìn)一步研究。

COLGALT2 是糖基轉(zhuǎn)移酶GLT25 家族成員之一，在HepG2.2.15 細(xì)胞株中顯著上調(diào)，其具有催化膠原糖基化修飾的糖基化轉(zhuǎn)移酶活性，介導(dǎo)膠原蛋白上的羥基賴氨酸G1cα1，2Gal β1-糖基化修飾[14]。眾所周知，HBV 感染所致的肝纖維化是肝硬化、肝癌的重要環(huán)節(jié)，在肝纖維化的初期，肝臟會(huì)表現(xiàn)出很強(qiáng)的再生修復(fù)能力，在損傷修復(fù)過程中，細(xì)胞外基質(zhì)的沉積是肝纖維化重要的生物學(xué)機(jī)制。細(xì)胞外基質(zhì)的沉積與膠原纖維糖基化修飾密切相關(guān)，相關(guān)研究已經(jīng)證明Colgalt2 介導(dǎo)的G1cα1 和2Gal β1-糖基化修飾具有促進(jìn)肝細(xì)胞再生及抗肝細(xì)胞凋亡的作用[15-16]。研究還發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶Glt25D2 可能參與HBV 包膜蛋白LHBs的Thr37 位糖基化修飾來影響LHBs 分泌，從而影響HBV 病毒顆粒的組裝[17-18]。

在HepG2.2.15 細(xì)胞株中也觀察到熱休克蛋白α8（heat shock protein 8，HSPA8）的上調(diào)。研究顯示，在HepG2.2.15 細(xì)胞株中過表達(dá)HSPA8 可增加HBV的復(fù)制，而通過干擾RNA 敲除HSPA8 的表達(dá)，可以很大程度上抑制HBV 的復(fù)制，但對(duì)宿主細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞毒性[19]。此外，還有研究顯示，氧麻黃堿的抗HBV作用是通過破壞HSPA8 mRNA 的穩(wěn)定性發(fā)揮抗HBV 的作用，這意味著HSPA8 是一個(gè)抗HBV藥物靶點(diǎn)[20-21]。以上的研究提示，HSPA8 可能在協(xié)助HBV 復(fù)制方面發(fā)揮著重要作用。

除以上所述的蛋白外，還有SEC14L2，DUSP6 和TIMELESS 等差異蛋白，既往研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白并不參與HBV 的感染，但與EB 病毒[22]、登革熱病毒[23]、HIV[24]、HCV[25]等其他病毒感染有關(guān)，以后的研究將進(jìn)一步對(duì)這些差異蛋白在HBV 感染中的作用進(jìn)行探討與研究，為HBV 致病的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。