翟 瑤，周丹娜，梁 婉，楊克禮，袁芳艷，郭 銳，李 鵬，田永祥

（1.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒引起的一種急性傳染病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸道癥狀和神經(jīng)癥狀等［1］。偽狂犬病毒能感染多種家畜及野生動物，而豬是偽狂犬病毒的自然宿主，且其最為易感，發(fā)病情況也最為嚴(yán)重［2］。偽狂犬病毒（Pseudo?rabies virus，PRV）可以引起種豬繁殖障礙，新生仔豬神經(jīng)癥狀及急性死亡、生長豬及育肥豬出現(xiàn)呼吸道癥狀等［3-5］。其臨床癥狀取決于感染豬的日齡、感染途徑、感染毒株的毒力及自身免疫情況等［6］。目前，豬偽狂犬病在全球范圍內(nèi)廣泛流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，很多國家采取了PRV凈化策略，歐洲的多數(shù)國家及加拿大、美國和新西蘭等已經(jīng)根除了該病毒［7，8］。隨著規(guī)模化養(yǎng)殖場的增多，2011年中國PRV出現(xiàn)了許多的變異毒株［9］，導(dǎo)致養(yǎng)殖場即使免疫了Bartha-K61疫苗也無法達(dá)到免疫效果。本研究從臨床病料中分離純化出1株豬偽狂犬病毒——HuB2020，并對其毒力、培養(yǎng)特性及遺傳變異進(jìn)行了系列研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 從湖北某豬場采集疑似病料，取組織樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒。胰酶、青鏈霉素雙抗和胎牛血清均購自Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司，DL 2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker以及高保真酶PrimeSTAR購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 細(xì)胞及試驗(yàn)動物 所用細(xì)胞為豬腎傳代細(xì)胞（PK15），試驗(yàn)動物為6周齡昆明小鼠。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA的提取及PCR檢測 將采集的組織病料加適量PBS溶液，勻漿破碎后反復(fù)凍融3次，離心取上清。按照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒說明書提取DNA。采用偽狂犬gD基因和gE基因外檢引物分別用于檢測偽狂犬病疫苗毒和野毒。

1.2.2 病毒的分離 以細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)基，用PBS溶液洗細(xì)胞2次，加入2 mL DMEM培養(yǎng)基（不含血清）、加入病毒液于37℃中孵育2 h，補(bǔ)足至DMEM（含2%FBS和1%青鏈霉素雙抗）6 mL，同時設(shè)置對照組。待80%左右的細(xì)胞出現(xiàn)病變并脫落時收取病毒液，于-80℃反復(fù)凍融3次后繼續(xù)傳代。將收取的病毒進(jìn)行純化，并使其在PK15細(xì)胞穩(wěn)定傳代。

1.2.3gE基因序列遺傳進(jìn)化分析 用Primer Pre?mier 5設(shè)計gE基因長片段引物，PCR擴(kuò)增獲得gE基因，經(jīng)過測序獲取基因序列。通過軟件DNAStar分析該病毒基因序列與NCBI上已公布的PRVgE基因序列（表1）的同源性，利用MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，對基因序列遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析。

1.2.4 PRV HuB2020株的病毒滴度測定 從培養(yǎng)箱中取出已鋪好的96孔板，將純化后的病毒液按10倍梯度稀釋，取10-1～10-88個稀釋梯度接種于96孔板，每個稀釋度8孔，每孔接種100μL，并設(shè)置陰性對照，對照孔每孔加入100μL DMEM。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，每天記錄觀察，按照Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.2.5 PRV HuB2020株在PK15細(xì)胞中的一步生長曲線 取細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗細(xì)胞2次，加入1 mL含100 TCID50的病毒液，于37℃CO2培養(yǎng)箱孵育2 h。然后換成2%FBSDMEM培養(yǎng)基，每隔12 h（12、24、36、48、60、72、84、96 h）吸取細(xì)胞上清液300μL，并補(bǔ)充同等體積的2%FBSDMEM培養(yǎng)基，測定8個時間節(jié)點(diǎn)病毒液的TCID50，并繪制生長曲線。

表1 PRV參考毒株信息

1.2.6 動物實(shí)驗(yàn) 6周齡昆明小鼠100只，分為5組，每組20只。分別以103.0、104.0、105.0、106.0TCID50/0.1 mL的滴度分別接種4組小鼠，接種劑量為0.1 mL，接種途徑為背部皮下注射，同時以20只小鼠注射同樣劑量的DMEM培養(yǎng)液作為陰性對照。接種后觀察小鼠臨床癥狀及死亡情況，按照Reed-Muench法分別計算病毒的半數(shù)致死量LD50，并以PCR方法檢測病毒在各組織的分布情況。每只小鼠分別取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟以及腦組織，破碎后取上清，按照AxyPrep的DNA/RNA提取試劑盒說明書提取組織DNA，以提取的組織DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果用GraphPad Prism5進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測結(jié)果

提取組織病料基因組DNA，用偽狂犬外檢引物進(jìn)行檢測。對分離出的病毒進(jìn)行PRVgD基因和gE基因短片段的PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖1）表明，擴(kuò)增出217 bp和368 bp的特異性目的條帶，與預(yù)期大小相符。

圖1 PRV gD/gE基因PCR檢測結(jié)果

2.2 病毒分離結(jié)果

將收集的病毒液在PK15細(xì)胞上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞在接毒24 h后有明顯的細(xì)胞病變，細(xì)胞變大變圓，呈空泡狀（圖2）。

圖2 HuB2020株感染PK 15的病變觀察（100×）

2.3 病毒生長動力學(xué)結(jié)果

HuB2020株在PK15細(xì)胞上的一步生長曲線結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，HuB2020株在36 h達(dá)到最高值106.5TCID50/0.1 mL，即107.5TCID50/mL，然后病毒滴度逐漸降低（圖3）。

圖3 HuB2020株在PK 15細(xì)胞上的一步生長曲線

2.4 gE基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

提取病毒基因組DNA擴(kuò)增gE基因長片段結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，成功擴(kuò)增出2 281 bp的特異性目的條帶，并與NCBI上已發(fā)表的序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，HuB2020株gE基因核苷酸序列與國外報道的PRV毒株的核苷酸序列同源性為97.6%～99.3%，與國內(nèi)報道的PRV毒株的核苷酸序列同源性為98.9%～99.9%；HuB2020株gE基因編碼的氨基酸序列與國內(nèi)流行變異株同源性為98.9%～99.9%，與 國 內(nèi) 經(jīng) 典 株Ea、Fa、TJ、HeN1等 的 同 源 性 為99.6%～99.8%，與國外經(jīng)典株Becker、Kaplan株等同源性為97.6%～97.9%。同時，基于gE基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，PRV-HuB2020株與國內(nèi)分離株屬于相同分支，親緣關(guān)系較近，與國外PRV經(jīng)典毒株Becker不屬于同一進(jìn)化樹分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖5）。

圖4 gE基因長片段擴(kuò)增

2.5 動物試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，106.0、105.0TCID50/0.1 mL攻毒組對小鼠的致死率為100%。感染HuB2020株的昆明小鼠半數(shù)致死量（LD50）為1×105.7。小鼠存活數(shù)量隨著稀釋度升高而增多（圖6）。PCR檢測組織嗜性分布結(jié)果顯示，106.0、105.0TCID50/0.1 mL攻毒組對小鼠的神經(jīng)嗜性高達(dá)100%，且病毒在腦組織和心臟組織中的檢出率均顯著高于其他組織（圖7）。

圖5 HuB2020株gE基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 小鼠攻毒后存活情況

圖7 小鼠組織感染情況

3 小結(jié)與討論

偽狂犬病是在世界范圍內(nèi)廣泛流行的一種動物傳染病，而且動物一旦感染，可終身帶毒、難以根除。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖場的增多，即使免疫了傳統(tǒng)偽狂犬疫苗也無法提供完全保護(hù)，甚至出現(xiàn)了許多的偽狂犬變異毒株。而目前對于該病的防控仍以疫苗免疫預(yù)防為主［10］。豬是偽狂犬病毒的主要宿主和惟一自然儲存宿主，感染該病毒的豬因日齡不同表現(xiàn)出不同的癥狀，新生仔豬感染后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及急性死亡，死亡率高達(dá)100%，生長豬以及育肥豬在感染后出現(xiàn)呼吸道癥狀等。目前，使用疫苗免疫仍然有流行變異株的出現(xiàn)，使偽狂犬病毒在宿主體內(nèi)適應(yīng)后發(fā)生基因突變，這些適應(yīng)性的突變也正是偽狂犬病毒實(shí)現(xiàn)跨宿主傳播而感染人。有研究報道偽狂犬病毒感染人的病例，但未能分離出病毒，Liu等［11］首次從人腦脊髓液中分離出偽狂犬病毒，該毒株與中國偽狂犬病毒流行變異株有著相似的生物學(xué)特性，這也進(jìn)一步表明偽狂犬病毒的可跨種傳播性，使偽狂犬病毒的防控已經(jīng)不再局限于動物，還有養(yǎng)殖行業(yè)的工作人員以及研究人員。目前在中國廣泛使用的疫苗有Bartha-K61、HB98、Ea株等，在偽狂犬病的臨床上有一定的防治作用，但對阻止病毒變異和傳播方面尚未有較好的效果。

本研究以PK15細(xì)胞從湖北省某豬場的疑似病料中分離出一株偽狂犬病毒。該病毒在PK15細(xì)胞上可以穩(wěn)定地增殖和傳代，并表現(xiàn)出明顯的偽狂犬病毒的細(xì)胞病變，感染病毒的細(xì)胞出現(xiàn)空泡，變大變圓；病毒純化后測定該病毒最高滴度為107.5TCID50/mL。gE基因長片段的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，該毒株與2011年以來國內(nèi)流行變異株同屬于一個分支，遺傳關(guān)系較近。小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，PRV-HuB2020株對小鼠毒力較強(qiáng)，對小鼠的半數(shù)致死量LD50為1×105.7，相較于Rui等［12］以SC株傳統(tǒng)強(qiáng)毒株的小鼠試驗(yàn)的毒力更強(qiáng)。組織PCR檢測組織嗜性分布結(jié)果顯示，該毒株對小鼠具有極強(qiáng)的神經(jīng)嗜性，且病毒在心臟組織中的檢出率也顯著高于其他組織，而這種對于心臟組織的嗜性在PRV的研究中鮮有報道。

該分離株為偽狂犬流行變異株且與國內(nèi)流行株同源關(guān)系較近，在PK15上增殖穩(wěn)定且對小鼠有高致死率，具有顯著的神經(jīng)嗜性及心臟組織嗜性。目前對于PR的防控主要以免疫疫苗為主，PRV仍在處于不斷變異的過程，對于養(yǎng)殖行業(yè)來說依舊有著潛在的風(fēng)險。