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        利用熒光探針檢測谷胱甘肽的實驗設(shè)計

        2021-06-24 04:05:26陳黎艷
        實驗室研究與探索 2021年5期
        關(guān)鍵詞:光度計羅丹明谷胱甘肽

        陳黎艷, 程 瑩, 費 崢

        (華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院,武漢 430079)

        0 引 言

        高等院校在國家創(chuàng)新體系中擔(dān)負(fù)著教學(xué)創(chuàng)新、科研創(chuàng)新、教育創(chuàng)新等職能,是國家培養(yǎng)創(chuàng)新人才的重要基地,因此,利用現(xiàn)有的各類教學(xué)資源和科研平臺為社會培養(yǎng)富有創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力的現(xiàn)代化人才是當(dāng)代高等院校的重要責(zé)任[1-4]?;瘜W(xué)專業(yè)是一門以實踐為主的學(xué)科,化學(xué)實驗教學(xué)巧妙地融合了實驗理論與實踐指導(dǎo)是培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)探索的意識和創(chuàng)新精神的重要途徑。相較于以操作技能培養(yǎng)和理論驗證為目的的傳統(tǒng)基礎(chǔ)化學(xué)實驗,綜合設(shè)計性實驗要求學(xué)生系統(tǒng)地完成基礎(chǔ)知識學(xué)習(xí)、文獻(xiàn)調(diào)研、數(shù)據(jù)分析和結(jié)果討論這樣一個完整的研究過程,這無疑對學(xué)生科學(xué)研究興趣和創(chuàng)造性思維的培養(yǎng)提供有力的幫助[5]。

        熒光探針是一種利用光譜學(xué)變化對特定目標(biāo)分析物進(jìn)行識別的高效探測器[6-7],本文依托于縱向科研項目,借助紫外可見分光光度計和熒光分光光度計研究了熒光探針分子對生物活性物種谷胱甘肽(GSH)的識別性能[8]。在實驗過程中學(xué)生的文獻(xiàn)閱讀、有機合成、儀器操作等技能得到了訓(xùn)練,創(chuàng)新思維和合作精神也得到了進(jìn)一步的培養(yǎng)。

        1 實驗內(nèi)容設(shè)計

        熒光探針技術(shù)可將分子間的相互作用轉(zhuǎn)化為易于監(jiān)測的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的變化,與傳統(tǒng)的高效液相色譜法、質(zhì)譜法、電化學(xué)檢測法等檢測方法相比,大大提高了靈敏度和準(zhǔn)確度。GSH是生物體內(nèi)具有生物活性的小分子生物硫醇,在細(xì)胞中參與基因調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和自由基清除等生理過程。然而,一旦GSH的含量超出細(xì)胞的正常水平,則會造成生物體氧化還原反應(yīng)失衡并對肝臟和腎臟代謝造成負(fù)擔(dān)。因此,GSH的定量和定性檢測對于生命科學(xué)和臨床診斷均具有重要意義[9-10]。羅丹明類熒光團具有摩爾消光系數(shù)大、量子產(chǎn)率高、水溶性好等優(yōu)點,因此在各類探針分子的設(shè)計中應(yīng)用廣泛[11]。GSH中巰基的親核能力較強,可以與鹵素原子(如Cl,Br)發(fā)生親核取代反應(yīng),因此碳鹵鍵成為GSH常見的識別集團[12]。本文將α-溴代酰胺連接至羅丹明熒光團,設(shè)計合成了新型的識別GSH的熒光探針RHO(見圖1)。在探針與GSH反應(yīng)之前,羅丹明螺環(huán)關(guān)閉,氧雜蒽結(jié)構(gòu)處于非共軛體系,因此探針本身無熒光發(fā)射且體系無顏色。當(dāng)GSH進(jìn)攻α-溴代酰胺結(jié)構(gòu)之后,在氫鍵的作用下羅丹明的羅內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)開環(huán),氧雜蒽結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為共軛體系,因此探針的熒光被打開,體系也隨之轉(zhuǎn)換成為肉眼可見的紅色(見圖1)。

        圖1 熒光探針檢測GSH反應(yīng)機理

        2 實驗儀器與試劑

        (1)實驗儀器。電子分析天平(LE104E,梅特勒托利多),恒溫磁力攪拌器(MYP19-2,上海梅穎浦儀器儀表有限公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Hei-VAP Core ML/G3,德國海道夫公司),核磁共振波譜儀(Bruker Mercury Plus 400 MHz,美國布魯克公司),手提式紫外燈(ZF-5,上海嘉鵬科技有限公司),熒光分光光度計(Cary Eclipse,安捷倫科技有限公司),紫外可見分光光度計(Cary 60,安捷倫科技有限公司)。

        (2)主要試劑。羅丹明B酰肼(95%~98%,天津希恩思生化科技有限公司),溴代乙酰溴(≥98%,Sigma-Aldrich),無水碳酸鉀(化學(xué)純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司),氘代二甲基亞砜-d6(≥99%,Sigma-Aldrich)。

        3 實驗操作

        (1)探針RHO的合成。將溴乙酰溴(3.0 mmol,606 mg)和無水碳酸鉀(3.0 mmol,414 mg)溶解于10 mL無水二氯甲烷中。將羅丹明B酰肼(2.0 mmol,912 mg)溶解于10 mL二氯甲烷并放置于恒壓低液漏斗,以15~20滴/min的速度滴加到反應(yīng)體系中。反應(yīng)2 h,用薄層析法監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程直至原料消耗完全。將50 mL碳酸氫鈉溶液加入反應(yīng)體系中,再用二氯甲烷萃取3次。合并有機相,用柱層析純化即可得到純凈的探針RHO(見圖2)。

        圖2 熒光探針RHO的合成路線

        (2)核磁共振波譜儀檢測。稱取8 mg探針粉末溶于5 mL氘代二甲亞砜中,用玻璃滴管轉(zhuǎn)移至干凈的核磁管內(nèi),用核磁共振波譜儀進(jìn)行檢測。

        (3)檢測溶液的制備。探針儲備溶液:稱取5.8 mg探針粉末溶于10 mL N,N-二甲基甲酰胺配制成為10 mmol/mL的探針儲備溶液。

        被檢測物儲備溶液:分別稱取適量的谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸、谷氨酸和組氨酸溶于PBS緩沖溶液中配制成為濃度為10 mmol/mL的被檢測物儲備溶液。

        待測液配制方法:①空白溶液。將300μL的無水DMF溶液與2.70 mL的PBS緩沖溶液混合。②探針參比溶液。在270μL的無水DMF溶液與2.70 mL的PBS緩沖溶液的混合溶液中加入30μL的探針儲備溶液。③實驗組待測溶液。270μL的無水DMF溶液與2.64 mL的PBS緩沖溶液的混合溶液中加入30 μL的探針儲備溶液,混合均勻后,分別加入60μL不同種類的被檢測物儲備溶液。

        (4)紫外-可見光譜測試參數(shù)。使用安捷倫Carry 60紫外-可見吸收光譜儀,1 cm吸收池,選擇吸收波長為500~650 nm。

        (5)熒光光譜測試參數(shù)。使用安捷倫Cary Elipse熒光分光光度計,1 cm石英池測定。激發(fā)波長為555 nm,發(fā)射波長為580 nm,狹縫為5/10 nm,電壓500 V,測試溫度25℃。

        4 結(jié)果與討論

        4.1 探針的核磁結(jié)構(gòu)表征

        探針RHO的1H表征數(shù)據(jù):9.94(1 H,s),7.82(1 H,m),7.64~7.41(2 H,m),7.12~6.92(1 H,m),6.58~6.42(2 H,m),6.33(4 H,d,J=2.1),3.76(2 H,s),3.39~3.30(8 H,m),1.12~1.06(12 H,t,J=6.9)。如該化合物的1H譜圖3所示,在(1.12~1.06)×10-6范圍內(nèi)出現(xiàn)的三重峰為4個甲基上的12個H(Ha);在3.30~3.39×10-6出現(xiàn)的四重峰可以歸屬為4個亞甲基的8個氫(Hb),3.76×10-6處出現(xiàn)的明顯的單峰為溴代酰胺α位置的2個氫(Hc);在9.94×10-6的位置能夠觀察到一個矮寬峰為亞氨基氫的特征峰型(Hd)。除此之外,譜圖6.0~8.0×10-6的范圍中可以觀察到5組氫分別對應(yīng)了探針芳基上的10個氫原子(HAr)。

        圖3 探針RHO的1 H NMR譜圖

        4.2 探針對谷胱甘肽的檢測性能

        分別將3 mL空白溶液、參比溶液和加入了谷胱甘肽的被檢測液放入1 cm的石英池中,在紫外分光光度計的作用下對500~650 nm范圍的紫外可見吸收進(jìn)行檢測。如圖4(a)所示,空白溶液及只加入了探針的參比溶液在此范圍內(nèi)均沒有發(fā)現(xiàn)明顯的紫外可見吸收峰;而當(dāng)加入了谷胱甘肽的被檢測液放入紫外分光光度計下進(jìn)行檢測時可觀測到在575 nm處出現(xiàn)了明顯的吸收峰。同樣地,將空白溶液、參比溶液及谷胱甘肽的待測溶液分別放入熒光分光光度計下用555 nm的激發(fā)波長,在565~650 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描可得如圖4(b)所示的結(jié)果:只有在谷胱甘肽加入的情況下才能觀測到明顯的熒光發(fā)射峰,空白和參比溶液均無法引起明顯的熒光發(fā)射光譜。

        圖4 空白溶液、探針參比溶液及探針RHO與谷胱甘肽作用的光譜圖

        4.3 檢測谷胱甘肽的特異性

        為了證明探針RHO對谷胱甘肽的檢測性能具有特異選擇性,需要在相同條件下檢測該探針對相似結(jié)構(gòu)氨基酸的檢測性能。因此,配制含有不同種類氨基酸(同型半胱氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸、谷氨酸和組氨酸)的待測溶液,并在同等檢測條件下觀測到的紫外吸收光譜及熒光發(fā)射光譜的變化。如圖5所示,將參比溶液以及加入不同種類氨基酸的待測溶液在紫外分光光度計和熒光分光光度計中掃描,可以發(fā)現(xiàn)只有谷胱甘肽加入的情況下可以觀測到575 nm的吸收峰以及在580 nm處出現(xiàn)的明顯發(fā)射峰,其他種類的氨基酸并未引起明顯的光譜變化,這說明探針RHO對谷胱甘肽的檢測能力具有特異選擇性。

        圖5 探針RHO與谷胱甘肽和其他氨基酸作用的光譜圖

        5 結(jié) 語

        本設(shè)計性實驗驗證了熒光探針分子RHO對生物活性小分子物種谷胱甘肽的特異性識別性能。學(xué)生需要完成一步條件溫和、污染性小且難度適中的有機合成反應(yīng)并借助紫外可見光譜儀、熒光分光光度計完成探針RHO的性質(zhì)驗證。此外,學(xué)生將在教師的輔助下學(xué)習(xí)用核磁共振波譜儀對有機化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗證,并將通過直接動手操作熒光分光光度計和紫外可見光分光光度計學(xué)習(xí)光譜特征在化合物性能驗證中的重要作用[13-16]。該設(shè)計性實驗包含了前沿文獻(xiàn)閱讀、相關(guān)文獻(xiàn)查閱、有機合成、結(jié)構(gòu)解析及化合物性質(zhì)驗證等過程,學(xué)生在設(shè)計性實驗的過程中得到了系統(tǒng)且全面的訓(xùn)練,有助于培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)研究興趣以及獨立思考解決問題的能力。

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