王怡杰，洪 雁*，顧正彪，程 力，李兆豐，李才明

（1．食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122；2．江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；3．江南大學(xué) 食品營(yíng)養(yǎng)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫214122）

稻谷是我國(guó)最重要的糧食作物之一，年產(chǎn)量達(dá)2億噸[1]。為調(diào)節(jié)糧食供求總量、應(yīng)對(duì)重大自然災(zāi)害及其他突發(fā)事件，國(guó)家每年會(huì)將大量稻谷作為儲(chǔ)備糧[2]。此外，作為米線、米糕等米制品加工原料及日常主食，生活中人們會(huì)習(xí)慣性儲(chǔ)藏成品糧大米。

由于稻谷加工過程去除了稻殼和糊粉層，胚乳直接暴露在外，在儲(chǔ)藏過程中，大米極易受外界溫度、濕度等影響[3]。目前國(guó)內(nèi)外研究主要集中于儲(chǔ)藏對(duì)大米化學(xué)組成、理化特性及蒸煮品質(zhì)的影響[4-9]。李潮鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)，大米峰值黏度和衰減值隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)及溫濕度增高顯著增加；Zhou等[7]研究顯示，大米儲(chǔ)藏期間起始糊化溫度To、峰值糊化溫度Tp、終值糊化溫度Tc、糊化焓ΔH逐漸增加，儲(chǔ)藏溫度越高趨勢(shì)越明顯；張杰等[2]研究表明，大米凝聚性、膠黏性、咀嚼性、米湯干物質(zhì)隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)顯著增加，大米吸水率、膨脹率顯著降低。

大米儲(chǔ)藏是淀粉、蛋白質(zhì)、脂類、細(xì)胞壁、酶等相互作用、相互影響的一個(gè)復(fù)雜過程，具體變化機(jī)理尚不明確[10]。儲(chǔ)藏期間大米淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)變化的研究相對(duì)較少。Huang等[11]、Wu等[12]發(fā)現(xiàn)，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，大米中的短鏈支鏈淀粉（聚合度6～15）所占比例增加，中長(zhǎng)鏈支鏈淀粉（聚合度16～50）所占比例降低。Gu等[13]研究顯示，大米儲(chǔ)藏過程中發(fā)生在短直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的分支點(diǎn)上的淀粉降解，導(dǎo)致淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。以顆粒形式存在的大米淀粉是大米的主要組成部分，淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)變化可能與大米儲(chǔ)藏過程中性質(zhì)及品質(zhì)變化有著密切關(guān)聯(lián)[14-15]。因此，本研究選用5種不同產(chǎn)地的當(dāng)年新產(chǎn)大米，人工加速儲(chǔ)藏后提取其中淀粉，系統(tǒng)探究?jī)?chǔ)藏時(shí)間對(duì)大米淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的影響，擬為大米儲(chǔ)藏過程中性質(zhì)及品質(zhì)變化機(jī)理提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同產(chǎn)地5種當(dāng)年新產(chǎn)粳米：1-興化米（江蘇泰州）、2-武育粳（江蘇射陽）、3-長(zhǎng)粒香（黑龍江哈爾濱）、4-秋田小町（吉林榆樹）、5-稻花香（黑龍江五常），均購于無錫米市。石油醚（30～60℃）、石油醚（60～90℃）、乙酸鉛、硫酸鈉、濃硫酸、氫氧化鈉、甲基紅等，均為分析純?cè)噭?，購于?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異淀粉酶：酶活10 000 U/mL，購于Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BXS-400S恒溫恒濕箱：購于上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；RJ-LD-50G低速離心機(jī)：購于無錫瑞江分析儀器有限公司；JHF 1000A快速多功能粉碎機(jī)：購于昆明鐵申商貿(mào)有限公司；Quanta 200掃描電子顯微鏡：購于荷蘭FEI公司；Mastersizer 2000激光粒度儀：購于英國(guó)Malvern公司；D8 Advance X-射線衍射儀：購于德國(guó)Bruker公司；IS10傅立葉紅外光譜儀：購于美國(guó)Nicolet公司；HPAEC檢測(cè)系統(tǒng)DIONEX ICS-5000+SP色譜柱、DIONEX ICS-5000+DC輸送泵、DIONEX AS-AP自動(dòng)進(jìn)樣器：均購于美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大米加速儲(chǔ)藏 參照姜平[3]的報(bào)道并略有改動(dòng)：稱取1 kg新產(chǎn)大米置于不銹鋼方盤（36 cm×27 cm×4.8 cm）中，后將若干不銹鋼方盤置于35℃、相對(duì)濕度（RH）75%的恒溫恒濕箱中并定時(shí)翻動(dòng)大米，每隔30 d取樣進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。

1.3.2 大米及大米淀粉制備 大米經(jīng)磨粉機(jī)粉碎，過150μm篩得大米粉，密封于干燥器中備用。大米淀粉用堿法提取，參照Takeda等[16]的報(bào)道并略有改動(dòng)。稱取一定質(zhì)量的大米粉與質(zhì)量濃度0.002 g/mL的NaOH溶液以質(zhì)量體積比1 g∶5 mL混合，磁力攪拌浸泡24 h。3 500 r/min離心10 min，棄去上清液并刮去表層暗黃色軟物質(zhì)。用濃度為1 mol/L的HCl溶液將漿液pH調(diào)至中性后再次離心（3 500 r/min，10 min），棄去上清液并用去離子水清洗沉淀多次。將沉淀置于45℃烘箱中干燥24 h，粉碎，過150 μm篩得到大米淀粉，密封置于干燥器中備用。

1.3.3 組分測(cè)定 水分測(cè)定：參照GB 5009.3中直接干燥法[17]；灰分測(cè)定：參照GB 5009.4中總灰分的測(cè)定方法[18]；蛋白質(zhì)測(cè)定：參照GB 5009.5中凱氏定氮法[19]；脂肪測(cè)定：參照GB 5009.6中索式抽提法[20]；淀粉測(cè)定：參照GB 5009.9中酸水解法[21]；直鏈淀粉測(cè)定：參照AACC 61-03方法[22]；脂肪酸值測(cè)定：參照GB/T 20569中乙醇提取法[23]。

1.3.4 顆粒結(jié)構(gòu)觀察 取少量樣品固定于專用導(dǎo)電雙面膠，經(jīng)離子濺射儀噴金固定，置于掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）下觀察樣品微觀形貌，加速電壓為5 000 V[24]。

1.3.5 粒徑分布測(cè)定 樣品處理及測(cè)試條件參照李玥[25]報(bào)道。

1.3.6 晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定 取少量樣品置于樣品板上壓片，采用X-射線衍射儀（X-ray Diffraction，XRD）測(cè)定大米淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)。測(cè)試條件：銅靶射線（λ=0.154 06 nm），掃描范圍4～40°（2θ），步長(zhǎng)0.05°，掃描速度2°/min，管電流10 mA，管電壓40 000 V。通過MDI Jade 6.0軟件對(duì)衍射圖譜進(jìn)行分析處理，參照徐斌等[26]曲線作圖法計(jì)算相對(duì)結(jié)晶度。

1.3.7 短程有序性測(cè)定 稱取一定質(zhì)量樣品與KBr以質(zhì)量比1∶60（以干基計(jì)）比例混合并研磨壓片，采用傅立葉紅外光譜儀（Fourier Transform-Infrared Spectrometer，F(xiàn)T-IR）透射模式掃描?？鄢諝獗尘?，測(cè)量范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1。參照Anugrahati等[27]報(bào)道用Omnic軟件對(duì)800～1 200 cm-1進(jìn)行傅立葉自去卷積處理，設(shè)置半峰寬和增強(qiáng)因子分別為19 cm-1和1.9，計(jì)算1 045 cm-1/1 022 cm-1的峰強(qiáng)度比值。

1.3.8 支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布測(cè)定 樣品前處理參照J(rèn)ane等[28]報(bào)道并略有改動(dòng)：稱取10 mg淀粉樣品（以干基計(jì)）溶于2 mL醋酸鈉緩沖液（pH 3.5）并于沸水浴中糊化30 min，冷卻后置于37°C水浴振蕩器中，加入100μL異淀粉酶，反應(yīng)24 h，沸水浴30 min終止反應(yīng)。樣品于8 000 r/min下離心30 min，取上清液過0.22μm纖維素微孔膜后采用高效陰離子色譜-脈沖安培檢測(cè)器（High Performance Anion Exchange Chromatography-Pulsed Amperometric Detector，HPAEC-PAD）進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相條件和測(cè)試條件參照Ren等[29]報(bào)道。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)操作，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。利用軟件Origin 8.5（美國(guó)OriginLab公司）對(duì)數(shù)據(jù)作圖，軟件SPSS 17.0（美國(guó)IBM公司）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 組分分析

不同儲(chǔ)藏時(shí)間5種大米組分如表1所示。隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，5種大米灰分及蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化未呈現(xiàn)明顯規(guī)律。大米中脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高，卻是影響大米儲(chǔ)藏品質(zhì)的重要因素[3]。在脂肪氧化酶和脂肪水解酶的作用下，大米中的脂類氧化水解生成羰基化合物、甘油和游離脂肪酸。脂肪酸又經(jīng)一系列反應(yīng)生成小分子的醛酮，產(chǎn)生刺激性氣味，最終影響大米食味品質(zhì)[4]。隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，5種大米脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低，脂肪酸值逐漸增加。這與王立群等[30]的研究結(jié)果一致，且儲(chǔ)藏溫度越高，脂肪氧化水解速度越快，脂肪酸值增加速度越快。5種大米儲(chǔ)藏期間淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈下降趨勢(shì)，推測(cè)與內(nèi)源淀粉酶水解淀粉生成糊精與麥芽糖，麥芽糖進(jìn)一步水解成小分子葡萄糖等還原糖有關(guān)[3]。直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)常被用作評(píng)定大米蒸煮品質(zhì)的重要指標(biāo)，隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，5種大米直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)未呈現(xiàn)顯著變化規(guī)律，這與先前報(bào)道中受脫支酶影響直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加的結(jié)果不一致，可能由不同品種大米內(nèi)源淀粉酶活性差異導(dǎo)致[31]。

2.2 顆粒結(jié)構(gòu)

不同儲(chǔ)藏時(shí)間5種大米淀粉顆粒掃描電鏡圖如圖1所示。大米淀粉顆粒呈現(xiàn)出典型的多角形。由于大米淀粉在大米中被蛋白網(wǎng)絡(luò)緊緊包裹和結(jié)合，化學(xué)提取可能會(huì)對(duì)淀粉顆粒造成不同程度的損傷，導(dǎo)致淀粉顆粒表面出現(xiàn)凹坑[32]。隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，5種大米淀粉顆粒結(jié)構(gòu)未呈現(xiàn)出明顯變化，這與Gu等[13]的報(bào)道結(jié)果一致。推測(cè)大米儲(chǔ)藏期間內(nèi)源性淀粉酶通過淀粉顆粒表面孔隙進(jìn)入內(nèi)部，淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)變化主要發(fā)生在淀粉顆粒內(nèi)部。

2.3 粒徑分布

不同儲(chǔ)藏時(shí)間5種大米淀粉粒徑分布如表2所示。D10、D50、D90分別表示樣品累積通過率為10%、50%、90%時(shí)的粒徑值[25]。5種大米淀粉的平均粒徑D50為5.21～6.16μm。隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，5種大米淀粉的粒徑分布未呈現(xiàn)顯著差異。結(jié)合SEM結(jié)果，儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)大米淀粉顆粒結(jié)構(gòu)影響較小，淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)變化可能發(fā)生在雙螺旋結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)、分子結(jié)構(gòu)等層面。

2.4 晶體結(jié)構(gòu)

淀粉雙螺旋通過分子間作用力形成晶體，稱為淀粉的晶體結(jié)構(gòu)或長(zhǎng)程有序結(jié)構(gòu)[32]。5種大米淀粉不同儲(chǔ)藏時(shí)間的X-射線衍射圖譜如圖2所示。大米淀粉在2θ角為15、17.5、18.7°及23.3°出現(xiàn)衍射峰，為典型的A型結(jié)晶峰；部分樣品在20°附近的衍射峰可能與直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物形成有關(guān)[15]。隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，5種大米淀粉的衍射峰強(qiáng)度均逐漸增強(qiáng)，相對(duì)結(jié)晶度不同程度增加，淀粉晶型未發(fā)生轉(zhuǎn)變。徐晉[31]認(rèn)為，大米儲(chǔ)藏過程中淀粉微晶束結(jié)構(gòu)增強(qiáng)可能與可溶性直鏈淀粉所占比例降低、不溶性直鏈淀粉所占比例增加有關(guān)。Gu等[13]研究表明，A型淀粉的分支點(diǎn)分散在無定型區(qū)和結(jié)晶區(qū)，在大米儲(chǔ)藏過程中，在短直鏈淀粉分子和支鏈淀粉分子的分支點(diǎn)上會(huì)發(fā)生淀粉降解，導(dǎo)致淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而影響雙螺旋間和螺旋內(nèi)氫鍵打斷所需的熱能（即熱力學(xué)焓值）。

表1 不同儲(chǔ)藏時(shí)間大米組分（干基）Table 1 Composition of rice during storage（dry basis）

圖1 不同儲(chǔ)藏時(shí)間大米淀粉掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrographs of rice starch during storage

2.5 短程有序性

淀粉分子中直鏈淀粉及短鏈支鏈淀粉形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)稱為淀粉短程有序結(jié)構(gòu)[32]。FT-IR分析淀粉顆粒信息有衰減全反射和透射兩種模式，前者僅分析顆粒表面2μm厚度的結(jié)構(gòu)信息，后者則可分析整個(gè)淀粉顆粒結(jié)構(gòu)信息[33]。本文采用透射模式。紅外光譜中1 045 cm-1附近吸收峰是結(jié)晶區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，對(duì)應(yīng)淀粉分子中有序結(jié)構(gòu)；1 022 cm-1附近吸收峰是無定型區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，對(duì)應(yīng)淀粉分子中無規(guī)則線團(tuán)結(jié)構(gòu)。因此，1 045 cm-1與1 022 cm-1處峰的強(qiáng)度比值可反映淀粉分子的短程有序性，比值越大，短程有序性越高[26]。

表2不同儲(chǔ)藏時(shí)間大米淀粉粒徑分布Table 2 Particle size distribution of rice starch during storage

圖2 不同儲(chǔ)藏時(shí)間大米淀粉X-射線衍射圖譜Fig.2 X-ray diffractograms of rice starch during storage

不同儲(chǔ)藏時(shí)間的5種大米淀粉，其紅外光譜中1 045 cm-1與1 022 cm-1處峰的強(qiáng)度的比值如圖3所示。隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，5種大米淀粉1 045 cm-1與1 022 cm-1處峰的強(qiáng)度比值均逐漸增加，短程有序性增加，推測(cè)可能與大米儲(chǔ)藏過程中支鏈淀粉短鏈比例增加有關(guān)。但也有研究認(rèn)為支鏈淀粉中長(zhǎng)鏈可以形成較長(zhǎng)的雙螺旋以及增強(qiáng)鏈段間氫鍵作用力，使結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定；聚合度（DP）6～12鏈段所占比例較高時(shí)會(huì)干擾結(jié)晶結(jié)構(gòu)的形成，過短的支鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)可能并不穩(wěn)定[34-35]。

圖3 不同儲(chǔ)藏時(shí)間大米淀粉1 045 cm-1與1 022 cm-1處峰的強(qiáng)度比值Fig.3 Peak intensity ratio(1045 cm-1/1022 cm-1)of rice starch during storage

2.6 支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布

淀粉經(jīng)異淀粉酶脫支后，支鏈淀粉酶解成一系列DP不同的線性短鏈，應(yīng)用HPAEC-PAD即可測(cè)定支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布情況。支鏈淀粉鏈段可分為4部 分：fa，DP 6～12；fb1，DP 13～24；fb2，DP 25～36和fb3，DP≥37[34]。Jane等[28]指出，相比于B型淀粉，A型淀粉中含有更高比例的fa鏈段和更低比例的fb3鏈段。直鏈淀粉幾乎不含分支結(jié)構(gòu)，因而不與脫支酶作用，由于其本身DP更大，與柱子的親和能力非常強(qiáng)，在測(cè)定時(shí)間內(nèi)不出峰，因此不會(huì)干擾支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布的測(cè)定[36-37]。不同儲(chǔ)藏時(shí)間5種大米淀粉支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布如表3所示。隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，5種大米淀粉的支鏈淀粉中fa鏈段增加，fb2和fb3鏈段減少，這一結(jié)果與Huang等[11]、Wu等[12]報(bào)道一致。推測(cè)大米儲(chǔ)藏過程中，內(nèi)源性α-淀粉酶水解無定形區(qū)中的長(zhǎng)鏈支鏈淀粉，產(chǎn)生許多短鏈淀粉小團(tuán)簇[11]，支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布發(fā)生變化，進(jìn)而影響淀粉的雙螺旋結(jié)構(gòu)和結(jié)晶結(jié)構(gòu)。

表3 不同儲(chǔ)藏時(shí)間大米淀粉支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布Table 3 Amylopectin chain length distributions of rice starch during storage%

3 結(jié)語

5種大米加速儲(chǔ)藏過程中，儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)大米淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的影響具體表現(xiàn)為：短鏈支鏈淀粉（DP 6～12）所占比例增加，中長(zhǎng)鏈支鏈淀粉（DP 25～36，DP≥37）所占比例降低；直鏈淀粉及短鏈支鏈淀粉形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)有序性增加；雙螺旋通過分子間作用力形成的淀粉微晶束結(jié)構(gòu)增強(qiáng)。大米儲(chǔ)藏是一個(gè)多組分相互作用的復(fù)雜過程，未來可深入探討淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)變化的原因及其對(duì)大米加工性能和食味品質(zhì)的影響，為大米儲(chǔ)藏的機(jī)理研究提供更多理論依據(jù)。