劉 超，宋瑾怡，薛艷紅，熊 澤，劉士平

（三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌443002）

草酸青霉（P.oxalicum）是一種廣泛分布于土壤、根際、食物及動(dòng)植物體內(nèi)等環(huán)境中的絲狀真菌[1]，可防治番茄枯萎病、油菜菌核病、棉花炭疽病、柑橘綠霉病等20余種植物真菌性病害[2-3]。草酸青霉在溶磷、分解纖維素和生物修復(fù)等方面也發(fā)揮著重要作用[4-6]。2013年，我國測定第一個(gè)草酸青霉菌株（114-2）的全基因組序列，并完成基因注釋：其基因組共約30 MB，預(yù)測有10 013個(gè)基因，編碼9 979個(gè)蛋白質(zhì)[7-9]。截止2020年4月，在GenBank數(shù)據(jù)庫中共有6條草酸青霉的全基因組序列[7，10-11]。

前期從三峽河岸帶地區(qū)篩選出兩株草酸青霉SG-4和SJ-3，發(fā)現(xiàn)其對柑橘致腐菌指狀青霉有強(qiáng)烈抑制作用[12]。通過活性追蹤和系統(tǒng)分離鑒定，得知其抑菌物質(zhì)是一種新型線性五肽（圖1），結(jié)構(gòu)是：O-Me-Baba-N-Me-Thr-Thr-N-Me-Val-Ser，其中Baba是β-氨基丁酸。進(jìn)一步研究表明該肽活性穩(wěn)定，對人體安全，是一種潛在抗生素和食品添加劑[12]。

自然界中寡肽的生物合成途徑有兩種，分別是核糖體途徑和非核糖體途徑[13-14]。前者指通過依賴核糖體的翻譯途徑合成寡肽，是一種初生代謝，在其基因組中一般存在目標(biāo)寡肽的重復(fù)序列；后者是由一種不依賴于翻譯途徑的非核糖體肽合成酶（NRPS，non-ribosomal peptide synthetase）所催化，是一種次級代謝，它是寡肽合成的主要途徑[15-16]。許多非核糖體肽是常見的抗生素，它們在醫(yī)藥、食品工業(yè)發(fā)揮了巨大作用[17-19]。根據(jù)NRPS的催化特點(diǎn)和寡肽的結(jié)構(gòu)，開發(fā)出一系列基于NRPS基因序列來分析預(yù)測寡肽的軟件，如fungiSMASH、NRPS predictor、Norine等，這些軟件為寡肽生物合成途徑研究提供了有利條件[20-22]。

為揭示新型五肽在草酸青霉中的合成機(jī)制，本研究測定了3株不同草酸青霉菌株的轉(zhuǎn)錄組序列，通過分析差異基因，從表達(dá)水平上確定候選合成基因簇，為剖析新型五肽合成機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 草酸青霉中的新型線性五肽Fig.1 New linear pentapeptide in P.oxalicum

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

BS-224s電子天平：德國賽多利斯公司產(chǎn)品；SW-CJ-2FD型雙人實(shí)驗(yàn)操作臺：蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；XPX-9052 MBE數(shù)顯培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；ZQZY-85BN全自動(dòng)控溫?fù)u床：上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；Master-s15和泰純水儀：上海和泰儀器有限公司產(chǎn)品；MyCyclerTMThermal PCR儀：美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；GDS-8000凝膠成像系統(tǒng)：美國UVP公司產(chǎn)品；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機(jī)：美國BECKMAN公司產(chǎn)品；DYCP-31DN水平電泳儀：北京市六一儀器廠產(chǎn)品；YM30F不銹鋼智能型立式電熱蒸汽消毒器：上海三申醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；島津高效液相色譜儀紫外-可見光檢測器（SPD-16），C8液相柱（YMCTriart C8 250 mm×4.6 mm）：島津儀器蘇州有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

土豆：市售；葡萄糖：科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；瓊脂：金燕海洋生物股份有限公司產(chǎn)品；色譜級乙腈：Tedia公司產(chǎn)品；真菌RNA提取試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司產(chǎn)品；GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2和T3 Super PCR Mix：均為北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)基

草酸青霉SG-4和SJ-3：來源于菌株均系三峽河岸帶植物疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）的內(nèi)生真菌；114-2：來源于山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，由本實(shí)驗(yàn)室自行分離獲得。以上菌株均保藏于4℃的PDA固體斜面培養(yǎng)基。PDA固體培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值自然，121℃滅菌20 min。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)與RNA提取

將保存在PDA固體斜面的3株草酸青霉菌種活化培養(yǎng)4 d，采用無菌操作取1環(huán)孢子接種于裝有200 mL的PDA液體培養(yǎng)基三角搖瓶中（總?cè)莘e500 mL），于28℃、120 r/min條件下培養(yǎng)7 d，采用Omega試劑盒提取總RNA，提取方法按試劑盒的操作方法進(jìn)行。

1.5 菌體質(zhì)量測定和線性五肽相對豐度檢測

將200 mL PDA液體中培養(yǎng)好的菌體抽濾，獲取不同培養(yǎng)時(shí)間的菌絲和發(fā)酵液，菌絲烘干后稱量。發(fā)酵液使用等體積無水乙醇混勻沉淀24 h，將上清液旋蒸凍干獲得粗提物，使用純水將粗提物配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液。采用島津高效液相色譜儀紫外-可見光檢測器（SPD-16），YMCTriart C8 250 mm×4.6 mm、粒徑5μm的C8色譜柱進(jìn)行反向高效液相分析。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為純水，超聲脫氣后使用；檢測波長為210 nm；進(jìn)樣體積為80μL；流量為1mL/min，柱箱溫度為35℃，梯度洗脫：0～20 min，B體積分?jǐn)?shù)由90%變?yōu)?%。記錄5～6 min處五肽相對峰面積。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測序

將質(zhì)量檢測合格的RNA樣品使用BGISEQ-500，進(jìn)行高通量RNA-Seq，具體過程如下：先用帶OligodT的磁珠富集有polyA尾巴的mRNA，再用DNA探針雜交rRNA，利用RNaseH選擇性消化DNA/RNA雜交鏈，再用DNaseI消化掉DNA探針，純化后即得到所需RNA。然后將RNA片段化，用隨機(jī)的N6引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步形成雙鏈DNA。將雙鏈DNA末端補(bǔ)平并進(jìn)行5′端磷酸化，3′端形成突出一個(gè)“A”的粘末端，再連接一個(gè)3′端有凸出“T”的鼓泡狀的接頭。然后連接產(chǎn)物通過特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和上機(jī)測序。

1.7 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以草酸青霉114-2為參考基因組進(jìn)行有參分析，用過濾軟件SOAPnuke進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用Trimmomatic進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean reads）；使用HISAT軟件和Bowtie2軟件將clean reads分別比對到參考基因組和參考基因序列上。根據(jù)比對結(jié)果，利用RSEM軟件定量分析，并以FPKM計(jì)算基因表達(dá)水平。差異表達(dá)分析重點(diǎn)在于找出樣本之間差異表達(dá)的基因，并對這些基因進(jìn)行深入挖掘分析。在分析中，差異表達(dá)基因默認(rèn)定義為FDR≤0.001且倍數(shù)差異在1倍以上的基因。篩選獲得的差異表達(dá)基因，根據(jù)GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）注釋進(jìn)行結(jié)果分類，同時(shí)使用R軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行富集分析。

1.8 NRPS分析

用 線 上 工 具antiSMASH（https：//fungismash.secondarymetabolites.org/#!/start?tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg）分析草酸青霉114-2的基因組序列，統(tǒng)計(jì)草酸青霉次生代謝產(chǎn)物基因簇，根據(jù)線上產(chǎn)物預(yù)測功能及NRPS的A型結(jié)構(gòu)域，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量分析NRPS基因簇。

1.9 RT-PCR驗(yàn)證

使用Oligo7軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，添加引物進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，所用的引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列Table 1 Primer sequences in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 不同草酸青霉菌株的生產(chǎn)能力比較

將SG-4、SJ-3和114-2這3株草酸青霉菌在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，收集發(fā)酵液后進(jìn)行高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，菌株114-2不產(chǎn)線性五肽，相比之下，來自于三峽河岸帶的SG-4和SJ-3線性五肽產(chǎn)量很高（圖2（a）），同時(shí)對指狀青霉顯示出很強(qiáng)的抑制效應(yīng)（圖2（b）），其中菌株SJ-3的產(chǎn)量明顯高于菌株SG-4（圖2（a））。

為了明確線性五肽的合成特點(diǎn)，以菌株SG-4為對象，分析了菌體生長規(guī)律和合成五肽的時(shí)期。結(jié)果顯示，菌體的生長從第6天開始進(jìn)入對數(shù)生長期（圖3（a）），而線性五肽在第4天開始累積，第8天達(dá)到最大值（圖3（b）），符合次生代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)。由于大多數(shù)寡肽由非核糖體肽合成酶（NRPS，non-ribosomal peptide synthetase）所催化，因此推測五肽極有可能由NRPS基因簇負(fù)責(zé)合成。

圖2 不同草酸青霉的五肽產(chǎn)量及抑菌效果Fig.2 Pentapeptide productionand antifungal effect of P.oxalicum strains

圖3 SG-4的生長曲線和五肽的合成時(shí)間Fig.3 Growth curve of SG-4 and synthesis time of pentapeptide

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量分析

為明確線性五肽的生物合成機(jī)制，將上述3株草酸青霉在PDA培養(yǎng)基上生長6 d后提取其總RNA，質(zhì)檢合格后在武漢華大基因科技有限公司使用BGISEQ-500平臺進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。由于114-2有完整的序列注釋信息，故在測序時(shí)使用它為參照序列進(jìn)行分析。

將測序的原始數(shù)據(jù)（raw reads）中低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基含量過高的數(shù)據(jù)過濾后，平均每個(gè)菌株產(chǎn)生了4 365萬條高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean reads），平均容量達(dá)6.55 GB，高質(zhì)量數(shù)據(jù)比例接近97%。將所獲得的clean reads使用HISAT進(jìn)行參考基因組序列比對，平均比對率達(dá)到91.65%（表2）。上述結(jié)果表明，此次測序的質(zhì)量有保證，結(jié)果可靠，而且3株草酸青霉的轉(zhuǎn)錄組序列均與參考基因組序列匹配程度高。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序概況Table 2 A survey of transcriptome sequencing

2.3 差異表達(dá)基因分析

按照差異的倍數(shù)（|log2（Fold Change）|）和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）來篩選差異表達(dá)基因，分析中將同時(shí)滿足|log2（Fold Change）|≥1且FDR≤0.001的轉(zhuǎn)錄本確定為差異表達(dá)基因[23]。3個(gè)轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)發(fā)生顯著變化的基因數(shù)如表3所示。

表3 差異表達(dá)的基因數(shù)Table 3 Number of genes differentially expressed

上述結(jié)果表明，產(chǎn)五肽的菌株SG-4和SJ-3，其差異表達(dá)基因比例只有16.32%，明顯比不產(chǎn)五肽的菌株114-2要少，這說明產(chǎn)五肽菌株的遺傳背景有一定的共性。因此，在后期的比較中重點(diǎn)關(guān)注在SG-4和SJ-3中有相同變化趨勢的基因，即114-2對SG-4及114-2對SJ-3中的2 239個(gè)基因（圖4）。

圖4 在114-2對SG-4和114-2對SJ-3中的差異表達(dá)基因Fig.4 Differentially expressed genes in 114-2 vs SG-4 and 114-2 vs.SJ-3

2.4 差異表達(dá)基因的功能注釋

對于3株草酸青霉（114-2，SG-4和SJ-3）共同差異表達(dá)的基因分別采用GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes）分類，富集分析了其可能的功能及所參與的細(xì)胞代謝過程。GO分類表明，上述1 823個(gè)基因主要參與生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生、細(xì)胞進(jìn)程、代謝過程、大分子復(fù)合物、細(xì)胞膜、細(xì)胞器及催化活性等生物學(xué)過程中（圖5（a））。而KEGG分類表明差異集中在糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及信號傳導(dǎo)過程（圖5（b））。GO富集表明，差異基因主要在調(diào)節(jié)催化活性、膜結(jié)構(gòu)與功能、氧化還原代謝等過程中發(fā)揮作用（圖5（c）），KEGG富集表明，差異基因主要集中在抗生素合成、脂肪酸分解和氨基酸代謝等途徑（圖5（d））。

圖5 差異基因表達(dá)分析Fig.5 Differential gene expression analyses

2.5 NRPS分析

由于草酸青霉所合成的線性五肽很有可能是由NRPS催化合成，因此利用線上分析工具antiSMASH[20]，分析數(shù)據(jù)庫內(nèi)草酸青霉114-2的全基因組序列中可能的NRPS基因簇，發(fā)現(xiàn)共有33個(gè)可能的NRPS。將這些NRPS在有參轉(zhuǎn)錄組中對應(yīng)后，分析其相應(yīng)的表達(dá)量（表4）。分析結(jié)果表明，在33個(gè)NRPS中，共有16個(gè)NRPS的表達(dá)量與五肽合成的變化趨勢一致（這16個(gè)NRPS在表4中用粗體給出），因此篩選范圍進(jìn)一步縮小。其中PDE_01071和PDE_01077屬同一個(gè)基因簇，因此共篩選出15個(gè)基因簇。

為保證篩選結(jié)果的正確性，對部分候選基因進(jìn)行了RT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，大多基因的表達(dá)均與測序結(jié)果一致，尤其是PDE_01071基因簇，該基因簇中有9個(gè)基因的表達(dá)在3株菌株中均存在明顯差異，相對于不產(chǎn)五肽的草酸青霉114-2，均為上調(diào)基因，而且RT-PCR結(jié)果與測序表達(dá)結(jié)果完全一致（圖6（a）），特別是結(jié)合了不同時(shí)間的表達(dá)情況，在生長4 d時(shí)該基因簇基本不表達(dá)（圖6（b）），與五肽的生產(chǎn)時(shí)間相吻合，而且該基因簇中有多個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶，說明該基因簇可能參與草酸青霉中線性五肽的合成。

表4 草酸青霉中所有候選NRPS基因的表達(dá)量Table 4 Expression of all candidate NRPS genes in P.oxalicum

圖6 RT-PCR驗(yàn)證表達(dá)結(jié)果Fig.6 RT-PCR to verify the expression

3 結(jié)語

本研究基于BGISEQ-500測序平臺，分析比較了3株草酸青霉在培養(yǎng)7 d時(shí)的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，并基于草酸青霉114-2的全基因組進(jìn)行了有參比對，同時(shí)對差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析；根據(jù)五肽的合成特點(diǎn)，篩選出一個(gè)最有可能負(fù)責(zé)草酸青霉中五肽合成的NRPS，即PDE_01071基因簇。值得一提的是，該結(jié)果與正在進(jìn)行的不同生長時(shí)期的無參轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相吻合（另文發(fā)表），所有這些嘗試為明確其生物合成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。后面的工作中，需對基因簇成員進(jìn)行針對性誘變，在明確酶活性和基因功能的基礎(chǔ)上，對其合成機(jī)理進(jìn)行解析。另外，NRPS催化寡肽合成的過程和機(jī)理很復(fù)雜，目標(biāo)產(chǎn)物是五肽，可是表3中候選NRPS的A結(jié)構(gòu)域的數(shù)字很少有等于5的，這可能是由于在合成中采用了迭代模式。