劉 梅，張晉欣，劉沙沙，馬 玥

（陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710119）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN），又稱F-2毒素，是由鐮刀菌屬真菌（禾谷鐮刀菌、青枯病鐮刀菌、赤霉病鐮刀菌和半裂鐮刀菌等）產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，即類(lèi)雌激素真菌毒素[1]。玉米赤霉烯酮是Stob等[2]于1962年從發(fā)霉玉米的真菌中分離到的一種代謝產(chǎn)物。ZEN具有類(lèi)雌激素作用，對(duì)動(dòng)物有許多不良影響，不僅會(huì)影響動(dòng)物生殖機(jī)能，還會(huì)產(chǎn)生免疫毒性、細(xì)胞毒性和遺傳毒性，損傷肝、腎等器官，甚至可能導(dǎo)致急性死亡。ZEN可與雌激素受體結(jié)合，激活其在體內(nèi)的反應(yīng)，從而引發(fā)一系列類(lèi)雌激素效應(yīng)[3]。妊娠期大鼠在產(chǎn)前暴露于ZEN作用下，會(huì)對(duì)母體及發(fā)育中的胎兒產(chǎn)生影響，并可能導(dǎo)致子一代成年雌性的長(zhǎng)期生殖損傷[4]。ZEN還會(huì)引起不同程度的男性生殖器官損傷，最終導(dǎo)致性功能下降，影響其生殖功能[5]。ZEN單獨(dú)存在或與其他霉菌毒素結(jié)合會(huì)對(duì)MA-10鼠間質(zhì)細(xì)胞系的體外細(xì)胞產(chǎn)生毒性[6]。在極低濃度下，ZEN能促進(jìn)細(xì)胞增殖、菌落形成和細(xì)胞遷移，且ZEN可導(dǎo)致DNA損傷[7]。

玉米赤霉烯酮主要分布于中國(guó)、日本、韓國(guó)、北歐、中歐等國(guó)家或地區(qū)，存在于玉米、大米、小麥、豆類(lèi)等糧油作物中[8]。玉米赤霉烯酮污染范圍廣、程度深、危害大，在世界各地的食品原料、飼料中均廣泛存在，此問(wèn)題急需得到妥善控制與解決。

毒素的污染與毒性是各個(gè)國(guó)家制定限量標(biāo)準(zhǔn)的重要依據(jù)，針對(duì)不同對(duì)象嚴(yán)格制訂相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)，有利于保障食品安全，使人民吃得放心、吃得安心。我國(guó)也提出了相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)，《GB 2761-2017食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[9]中規(guī)定：食品中谷物及其制品，包括小麥和小麥粉、玉米和玉米面（渣、片），ZEN的最高限量為60μg/kg。參照食品中玉米赤霉烯酮的限量標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)家也制定了糧油作物中玉米赤霉烯酮的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)行的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 食品中玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards for ZEN detection methods in food

譚新柳等[12]概述了色譜法、膠體金法、生物傳感器法等多種檢測(cè)方法對(duì)樣品中ZEN的檢測(cè)；譚紅霞等[13]則只從生物傳感器檢測(cè)技術(shù)方面對(duì)ZEN的檢測(cè)進(jìn)行論述?；谇叭藞?bào)告，作者主要介紹了玉米赤霉烯酮常見(jiàn)檢測(cè)技術(shù)的原理及優(yōu)缺點(diǎn)，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 色譜檢測(cè)法

色譜是利用不同組分在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)或溶解度不同的原理對(duì)各組分進(jìn)行分離純化，最終檢測(cè)物質(zhì)含量的一種方法。色譜分析法是小分子物質(zhì)檢測(cè)最常用的一類(lèi)檢測(cè)手段，包括薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和質(zhì)譜法（MS）等[14-17]。

薄層色譜法是早期應(yīng)用于檢測(cè)的一種方法，是對(duì)混合樣品進(jìn)行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)[18]。Schaafsma等[19]采用了不同種方法檢測(cè)谷物中ZEN含量，結(jié)果表明TLC法成本最低、耗時(shí)短，且對(duì)設(shè)備和人員要求不高，但存在操作過(guò)程復(fù)雜、專(zhuān)一性差、靈敏度低、重復(fù)性差的缺點(diǎn)[20]，而且實(shí)驗(yàn)員需接觸大量有毒有害試劑，因此逐漸停止使用?，F(xiàn)在最常用的檢測(cè)方法是液相色譜、氣相色譜和質(zhì)譜。這些方法一般需應(yīng)用大型儀器，分析比較迅速、靈敏度高、檢測(cè)限低，但前處理復(fù)雜、成本高，且大型儀器需專(zhuān)業(yè)人員操作[21-22]，檢測(cè)要求較高?，F(xiàn)階段色譜法檢測(cè)主要用于多種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)，如黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素等。液相或氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用適合對(duì)多種待測(cè)物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行定量檢測(cè)，且靈敏度較高。Kafouris等[23]用乙腈/水混合物單步萃取ZEN，再用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析，該方法無(wú)須任何清洗步驟，靈敏度高。Wang等[24]采用渦流輔助離子-液基分散液-液微萃取相結(jié)合的方法，對(duì)玉米制品中的ZEN進(jìn)行高效液相色譜分離和熒光檢測(cè)。該方法前處理簡(jiǎn)單、凈化效果好、靈敏度高、檢測(cè)速度快，適用于ZEN殘留的分離和定量檢測(cè)?？梢?jiàn)，聯(lián)用技術(shù)在ZEN檢測(cè)方面有著廣大的應(yīng)用前景（表2）。

表2 色譜法檢測(cè)ZEN的線性范圍及檢測(cè)限Table 2 Linear range and detection limit of ZEN by chromatography

2 免疫分析法

免疫分析法是利用目標(biāo)分子和抗原競(jìng)爭(zhēng)并與抗體結(jié)合的原理，檢測(cè)真菌毒素的一種方法，常采用與熒光標(biāo)記相結(jié)合的策略追蹤目標(biāo)物。常見(jiàn)的免疫分析法包括酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）、免疫親和柱-熒光光度法和膠體金免疫分析法等[25-27]。

因?yàn)榭贵w-抗原的特異性結(jié)合具有較高的親和性，免疫分析法一般都具有專(zhuān)一性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，酶聯(lián)免疫法和側(cè)流試紙條法在ZEN檢測(cè)方面應(yīng)用十分廣泛。ELISA分析法在實(shí)際應(yīng)用中常被制成試劑盒，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高。膠體金免疫層析法也具有檢測(cè)速度快、檢測(cè)限低的優(yōu)點(diǎn)。但是，抗體和抗原制備較困難且不易保存，成本高、重復(fù)性差等缺點(diǎn)常限制其應(yīng)用[28-30]。Hendrickson等[31]建立了一種基于磁性鐵納米顆粒（MNPs）的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定ZEN，如圖1所示。該方法以高度分散的MNPs為載體固定抗體，基于MNP的免疫吸附劑與大體積樣品中游離的ZEN相互作用，并將其轉(zhuǎn)移到較小體積（分析物的初始濃度），然后與ZEN-光氧化物酶復(fù)合物結(jié)合；未反應(yīng)組分中的MNP-抗體-ZEN/ZEN-辣根過(guò)氧化物酶（HRP）復(fù)合物經(jīng)過(guò)磁性分離后，體系中再加入化學(xué)發(fā)光底物與HRP反應(yīng)，進(jìn)行測(cè)定。該方法對(duì)ZEN的檢測(cè)限達(dá)4 pg/mL。但由于抗體的加入使成本較高，不易控制。且實(shí)際檢測(cè)中可能出現(xiàn)重復(fù)性差、假陽(yáng)性率高等情況，樣品中的氧化酶、蛋白酶等也可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。為獲得更穩(wěn)定的檢測(cè)方法，Duan等[32]以QBs作為新型熒光探針，建立了側(cè)向免疫層析法,用于谷物中ZEN含量的定量檢測(cè)，如圖2所示，其熒光強(qiáng)度約為相應(yīng)QDs的2 800倍。首先采用微乳液法制備有機(jī)可溶性CdSe/ZnSQDs膠囊，獲得強(qiáng)熒光QBs；接下來(lái)合成QB-mAbs探針，并將樣品與探針預(yù)混合，加入樣品墊；QB-mAbs與ZEN的免疫復(fù)合物同IgG發(fā)生反應(yīng)，在檢測(cè)線（T線）上形成熒光帶；多余的QB-mAbs被控制線(C線)捕獲結(jié)合，在C線上形成熒光帶，樣品中ZEN含量越多，測(cè)試線上熒光強(qiáng)度越低。得到ZEN的線性范圍為0.125～10 ng/mL，檢測(cè)限為0.0625 ng/mL。

圖1 磁吸附-酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定ZEN原理圖[31]Fig.1 Schematic presentation of ZEN determination by MNPs-ELISA

與光度法相比,熒光分析法通過(guò)監(jiān)測(cè)體系熒光信號(hào)前后變化對(duì)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，靈敏度較高，可檢測(cè)微量或超微量樣品。Zhan等[33]建立了一種直接競(jìng)爭(zhēng)熒光酶聯(lián)免疫吸附法，如圖3所示。該方法將易受H2O2影響的CdTe QDs（MPA-QDs）作為熒光信號(hào)輸出；ZEN與過(guò)氧化氫酶（CAT）結(jié)合，代替HRP標(biāo)記的ZEN作為競(jìng)爭(zhēng)抗原。在沒(méi)有ZEN時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)抗原（ZEN-CAT偶聯(lián)物）表面ZEN被微板上的ZEN單抗捕獲。CAT消耗了H2O2，MPA-QDs的熒光存在橙色熒光。存在ZEN時(shí)，ZEN與ZEN單克隆抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，與ZEN單抗結(jié)合的CAT降低，未被消耗的H2O2抑制MPA-QDs的熒光，導(dǎo)致熒光信號(hào)較低。此法中ZEN定量線性范圍為2.4 pg/mL～1.25 ng/mL，檢測(cè)限為4.1 pg/mL。

圖2 QBs-側(cè)向流動(dòng)免疫熒光試紙條測(cè)定ZEN原理圖[32]Fig.2 Schematic presentation of ZEN determination with QBs-lateral flow immunofluorescence strip

圖3 熒光酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定ZEN原理圖[33]Fig.3 Schematic presentation of the determination of ZEN by fluorescence-linked immunosorbent assay

基于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求，Li等[34]建立了一種橫向流動(dòng)免疫色譜法測(cè)定谷物中ZEN的方法，如圖4所示。銀納米粒子（AgNPs）的吸收峰在430 nm處，對(duì)碳點(diǎn)（CD）在459 nm處的發(fā)射峰有強(qiáng)猝滅作用。CD與卵蛋白（OVA）結(jié)合形成CD-OVA，作為供體信號(hào)探針；AgNP-Ab作為受體信號(hào)探針。樣品和AgNPAb信號(hào)探針在樣品墊處預(yù)混合。不存在樣品時(shí)，AgNP-Ab與ZEN-OVA（T線）結(jié)合并使CD-OVA（C線）熒光猝滅，Ab被C線捕獲，T線無(wú)熒光、有AgNP紫外吸收，C線有藍(lán)色熒光、有AgNP紫外吸收；存在樣品時(shí)，T線與ZEN競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合AgNP-Ab，T線熒光不完全猝滅，Ab被C線捕獲；T線有藍(lán)色微弱熒光、無(wú)AgNP紫外吸收，C線有熒光、有AgNP紫外吸收。谷物樣品中ZEN檢測(cè)線性范圍為1～2.5μg/kg，檢測(cè)限為0.1μg/L。此法在檢測(cè)性能改善的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了大通量檢測(cè)。免疫色譜分析法將免疫分析方法的快速、特異性與儀器分析方法的精確性等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，比HPLC更穩(wěn)定、可靠，已成為ZEN定量檢測(cè)的重要方法。表3列舉了免疫分析法檢測(cè)ZEN的線性范圍和檢測(cè)限。

3 生物傳感器法

生物傳感器是利用酶、抗體、抗原、微生物、組織、核酸、細(xì)胞器、全細(xì)胞等生物識(shí)別元件，將相互作用轉(zhuǎn)化為可測(cè)信號(hào)的一類(lèi)化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)裝置[35]。一般以光學(xué)、電化學(xué)等為輸出信號(hào)。根據(jù)傳感器的類(lèi)型，生物傳感器主要分為四種類(lèi)型：電化學(xué)生物傳感器、光學(xué)生物傳感器、測(cè)溫生物傳感器和壓電生物傳感器[36]。均具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)等特點(diǎn)[37]。

隨著光學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，光學(xué)生物傳感器的發(fā)展十分迅速，它能夠在復(fù)雜樣品中檢測(cè)目標(biāo)而不需要復(fù)雜的預(yù)處理，在食品安全控制中有重要的應(yīng)用前景。干擾小、噪音低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)使其成為檢測(cè)食品小分子污染物的理想選擇。

圖4 橫向流動(dòng)免疫色譜法測(cè)定谷物中的ZEN原理圖[34]Fig.4 Schematic presentation of ZEN determination in the grain by transverse flow immunochromatography

表3 免疫分析法檢測(cè)ZEN的線性范圍和檢測(cè)限Table 3 Linear range and detection limit of ZEN detected by immunoassay

Wu等[38]建立了一種利用金納米顆粒（AuNPs）結(jié)合適配體探針來(lái)檢測(cè)糧食中的ZEN的側(cè)向流動(dòng)試紙條法，如圖5所示。此法基于DNA1（在T線上）與樣品ZEN對(duì)AuNPs-Apt的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。沒(méi)有ZEN時(shí)，AuNPs-Apt與DNA1通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合形成AuNPs-Apt-DNA1（T線），AuNPs-Apt與DNA2通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合形成AuNPs-Apt-DNA2（C線），此時(shí)試紙條上有兩條線；存在ZEN時(shí)，AuNPs-Apt與ZEN結(jié)合，減弱AuNPs-Apt與DNA1的結(jié)合，T線的顏色變淺，T線的深淺取決于溶液中的ZEN濃度，而AuNPs-Apt與DNA2的結(jié)合不受ZEN的影響，C線顏色不變。此法中，ZEN定量檢測(cè)的線性范圍為5～200 ng/mL，檢測(cè)限為20 ng/mL。此法克服了適配體的局限性：無(wú)須在實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)展，可用肉眼觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。作為一種產(chǎn)品使用，可以為眾多食品污染物和樣品提供快速、簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)方法。

Goud等[39]采用高水分散性的去角質(zhì)功能化氧化石墨烯（FGO）作為FAM熒光的猝滅劑，F(xiàn)AM-apt為熒光基團(tuán)，定量檢測(cè)ZEN，如圖6所示。無(wú)目標(biāo)時(shí)，F(xiàn)GO與FAM-適配體之間π堆疊形成復(fù)雜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致FAM-適配體熒光猝滅；有目標(biāo)時(shí)，目標(biāo)與適配體特異性結(jié)合，減弱FGO與FAM-適配體相互作用，熒光恢復(fù)。ZEN檢測(cè)線性范圍0.5～64 ng/mL，檢測(cè)限0.5 ng/mL。此法中，F(xiàn)GO的作用是：降低背景信號(hào)，提高信噪比。大多數(shù)常用熒光團(tuán)標(biāo)記物的熒光壽命較短，且需要特定的存儲(chǔ)條件來(lái)穩(wěn)定其熒光響應(yīng)，導(dǎo)致熒光法測(cè)定成本較高。在此背景下，未來(lái)的工作方向可以通過(guò)整合熒光納米顆粒作為適配體標(biāo)簽研究如何進(jìn)一步提高檢測(cè)性能。大多數(shù)納米材料粒子能抑制過(guò)氧化物酶活性，這種抑制作用同樣會(huì)影響過(guò)氧化物模擬酶的活性。Sun等[40]研制了一種AuNPs比色適配體傳感器用以檢測(cè)ZEN，如圖7所示。金納米粒子（AuNPs）具有類(lèi)似過(guò)氧化物酶的活性，而ZEN適配體可抑制其活性。無(wú)ZEN時(shí)，適配體被靜電吸附在AuNPs表面，抑制AuNPs催化H2O2氧化3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB），形成AuNPs表面屏蔽現(xiàn)象；有ZEN時(shí)，適配體與ZEN特異性結(jié)合，適配體結(jié)構(gòu)改變，不能與AuNPs表面形成靜電吸附，AuNPs催化H2O2氧化TMB，使無(wú)色的TMB轉(zhuǎn)變成藍(lán)色的oxTMB，吸光結(jié)果在630 nm處測(cè)定。ZEN檢測(cè)線性范圍為10～250 ng/mL，檢測(cè)限為10 ng/mL。此法不是基于未加控制的聚合，而是基于模擬酶活性，故靈敏度高。在實(shí)際樣品分析中，此法的高特異性和可行性說(shuō)明其在ZEN檢測(cè)方面有巨大潛力。此法只是一項(xiàng)利用過(guò)氧化物酶樣活性進(jìn)行比色分析的初步試驗(yàn)，后續(xù)可考慮結(jié)合AuNP等納米材料或信號(hào)放大策略，提高靈敏度，拓寬分析范圍。

圖5 適配體側(cè)向流動(dòng)試紙條檢測(cè)ZEN原理圖[38]Fig.5 Schematic presentation of ZEN detection for aptamer-based lateral flow strip

圖6 FGO熒光猝滅傳感器測(cè)定ZEN原理圖[39]Fig.6 Schematic presentation of ZEN detection by FGOfluorescence quenching sensor

圖7 AuNPs比色適配體傳感器檢測(cè)ZEN原理圖[40]Fig.7 Schematic presentation of ZEN detection byAuNPs colorimetric aptamer sensor

Taghdisi等[41]以核酸適配體、金納米顆粒及基于核酸外切酶輔助的循環(huán)放大建立非靶向核酸適配體傳感器，對(duì)ZEN進(jìn)行比色檢測(cè)，如圖8所示。

適配體和cDNA分別被固定在AuNPs表面（Apt-AuNPs和cDNA-AuNPs）；適配體DNA和cDNA在AuNPs表面距離靠得很近，會(huì)引起堿基互補(bǔ)配對(duì)雜交，此時(shí)加入核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ），會(huì)作用于雙鏈DNA的3′末端，使cDNA從3′端消解，使得AuNPs表面裸露出來(lái)，再加入4-甲基苯酚，其到達(dá)AuNPs表面并被還原為4-氨基苯酚，環(huán)境顏色由黃色變?yōu)闊o(wú)色；而在ZEN存在的情況下，適配體DNA與ZEN特異性結(jié)合，cDNA以單鏈狀態(tài)存在，對(duì)ExoⅢ消化有抗性，AuNPs表面空間位阻大，直徑大，到達(dá)AuNPs表面的4-甲基苯酚較少，環(huán)境顏色保持黃色不變，此時(shí)測(cè)定其吸光值。這種方法的線性范圍為20～8 000 ng/L，檢測(cè)限達(dá)到10 ng/L。ExoⅢ輔助信號(hào)的放大產(chǎn)生了優(yōu)異的傳感性能，在樣品中的應(yīng)用進(jìn)一步證明了其可靠性，表明所設(shè)計(jì)的適配體傳感器是一種很有前途的ZEN檢測(cè)分析技術(shù)（表4）。

圖8 Walker循環(huán)放大比色適配體傳感器檢測(cè)ZEN原理圖[41]Fig.8 Schematic presentation of ZEN detected by the Walker loop magnification colorimetric aptamer sensor

表4 生物傳感器法檢測(cè)ZEN的線性范圍和檢測(cè)限Table 4 Linear range and detection limit of ZEN detected by biosensor

4 展望

近年來(lái)，食品和飼料中ZEN的全球性污染嚴(yán)重威脅生態(tài)環(huán)境安全和人類(lèi)健康。因此，建立和完善相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)是分析檢測(cè)工作的重要方向。早期的薄層色譜法成本低，操作簡(jiǎn)便，但耗時(shí)長(zhǎng)，精確度低；高效液相色譜法提高了檢測(cè)的精確度，但操作煩瑣，成本偏高；隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)了多種毒素同時(shí)檢測(cè)，且進(jìn)一步提高了檢測(cè)靈敏度和結(jié)果穩(wěn)定性，但使用的儀器過(guò)于昂貴。適配體生物傳感器的方法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的諸多不足，但這種方法還有待進(jìn)一步發(fā)展與探究。若要實(shí)現(xiàn)對(duì)食品安全的監(jiān)管，今后應(yīng)從以下幾個(gè)方面展開(kāi)研究：（1）滿足快檢要求。借助比色等檢測(cè)技術(shù)，建立可視化分析方法，滿足日常監(jiān)管需要。（2）高靈敏度和特異性。將各種方法結(jié)合使用，進(jìn)一步提高檢測(cè)方法的靈敏度和特異性。（3）多種毒素同時(shí)檢測(cè)。日常食品檢測(cè)大多需要多毒素同時(shí)分析，多種毒素同時(shí)檢測(cè)的方法可以節(jié)省時(shí)間和成本。

綜上所述，建立快速、準(zhǔn)確、高靈敏度、低成本的ZEN檢測(cè)方法仍是食品安全領(lǐng)域的研究方向。