王亞聰，田紅雨，王照玉，史曉夢，張書蔚，冉隆賢,2

(1河北農(nóng)業(yè)大學 林學院，河北 保定 071000；2河北省林木種質(zhì)資源與森林保護重點實驗室，河北 保定 071000)

桉樹(Eucalyptusspp.)又稱尤加利樹，具有種類多、適應性強、生長快等優(yōu)點，自然分布于澳大利亞等地區(qū)，在我國廣西、廣東和海南等地均有引種栽培，已成為我國三大造林樹種之一，面積居世界第三位，僅次于巴西和印度[1-2]。

桉樹青枯病是由茄拉爾式菌[Ralstoniasolanacearum(Smith) Yabuuchietal.]侵染引起的，該病原菌屬生理小種1號，包括Ⅰ和Ⅲ2種生物型，與木麻黃 、番茄、甘薯等青枯病菌在染色反應、形態(tài)特征及理化特性上相同，并且與在不同桉樹品種和地理種源分離得到的青枯病菌株的致病力基本一致[3-4]。近年來隨著桉樹人工林的快速發(fā)展，桉樹青枯病的發(fā)生日趨嚴重，影響了我國桉樹產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，生產(chǎn)上多采用抗病品種選育和化學防治的方法防治桉樹青枯病，但多數(shù)抗病品種的種源有限，且存在抗病能力不穩(wěn)定的現(xiàn)象，而化學防治不僅容易產(chǎn)生抗藥性，而且還容易污染環(huán)境，威脅人畜的安全健康[5-6]。另外，從我國青枯病的發(fā)生規(guī)律來看，雖然青枯病主要發(fā)生在長江以南地區(qū)，但是隨著氣候變化以及南北交流日益緊密，青枯病的發(fā)生已有由南向北擴展的趨勢，所以需要采取有效的措施防止其繼續(xù)擴展為害[7]。

青枯菌是一種由許多遺傳群組成的物種復合體，具有廣泛的寄主范圍和地理分布，在土壤中能存活較長時間[8-9]，可侵染53個科的450多種植物[10-11]，但其在寄主范圍、分布區(qū)域、致病能力和生理生化等方面也存在明顯差異。目前國際上公認的2種分類方法分別是依據(jù)青枯菌對寄主植物的致病能力或?qū)θ侨嫉难趸芰⑵浞譃?個生理小種和5個生物型[12-14]。青枯菌生理小種1號的寄主范圍較廣，可侵染番茄、煙草、辣椒等茄科植物及許多其他科的植物；生理小種2號只侵染香蕉和海里康屬的植物；生理小種3號主要侵染馬鈴薯，偶爾侵染番茄、茄子[14]；生理小種4號和5號分別對姜和桑樹有較強的致病力，對其他植物致病力微弱或不致病，但對于除生理小種1號的Ⅰ和Ⅲ2種生物型對桉樹有較強的致病力外，其他生理小種和生物型是否對桉樹具有侵染能力還未見報道[15-16]。在測定青枯菌對植物的致病能力的研究中，常用的接種方法有很多，其中常見的有頂端接種、傷根灌淋菌液法和WFT法等，而與常用的接種方法相比莖段浸泡法操作更為簡單快速，且結(jié)果也更為接近林間植物發(fā)病的實際情況[17]。因此，研究中利用常規(guī)的頂端接種和更方便快捷的浸泡接種2種方法探究青枯菌不同生理小種和生物型對桉樹的致病能力，系統(tǒng)地分析了不同青枯病菌的致病規(guī)律，以更好地針對不同生理小種及生物型采取不同的防治措施，并降低青枯病危害桉樹種植的風險，同時也為營造桉樹人工林和綜合防治桉樹青枯病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物：健康尾葉桉幼嫩枝條，采自于河北農(nóng)業(yè)大學溫室。

供試培養(yǎng)基：KB培養(yǎng)基[18]和TTC培養(yǎng)基[19-20]。

供試菌株：研究中所使用的青枯菌不同生理小種和生物型菌株的特性和來源見表1。

表1 供試青枯菌信息Table 1 Characteristics of Ralstonia solanacearum strains used in this study

1.2 方法

1.2.1 強致病力菌株的活化和培養(yǎng) 將保存的青枯病菌不同生理小種和生物型的菌懸液分別涂布于KB培養(yǎng)基上進行活化培養(yǎng)，2 d后挑取單菌落在TTC培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后挑取乳白色菌落或中間有一點淡紅色的菌落在KB培養(yǎng)基上純化。

1.2.2 菌懸液的制備 將獲得的強致病力菌株純化培養(yǎng)2 d后，用無菌水沖洗細菌菌體，配制成濃度為1.0×108CFU/mL的菌懸液，稀釋10倍，濃度為1.0×107CFU/mL，備用。

1.2.3 青枯菌不同生理小種對桉樹的致病性測定

頂尖接種法：將采回的尾葉桉健康幼嫩枝條沖洗干凈，用鋒利的刀片切成長度為10 cm左右的莖段，保留部分葉片，形態(tài)學上端切斜口，下端切平口，再置于裝有30 mL冷卻白開水的小三角瓶或小燒杯中，每瓶5個莖段，每個處理3瓶。分別取菌株GIM 1.76、Po 88、Z 2013-1和GIM 1.73的菌懸液2 μL接種于莖段的上端切口，以接種同體積的桉樹青枯病菌Rrpr菌懸液和無菌水為對照，用保鮮膜封口，于30 ℃光暗12 h交替保濕培養(yǎng)，每天觀察和記錄發(fā)病情況，接種3～7 d后計算發(fā)病率和病情指數(shù)。

其中，病情指數(shù)=[Σ(各級病株數(shù)×相應分級的代表數(shù)值)/(總株數(shù)×最高級代表值)]×100。

病害分級標準：0級為無癥狀；1級為變黑莖段長度小于0.5 cm；2級為變黑莖段長度 0.5～2.0 cm；3級為變黑莖段長度2.0 cm以上或整個莖段全部變黑、死亡[21]。

莖段浸泡法：按照上述方法制備10 cm左右的桉樹莖段，分別插入含有50 mL濃度為107CFU/mL的4個青枯菌菌懸液的小三角瓶或小燒杯中，以接種同體積的桉樹青枯菌Rrpr菌懸液和無菌水為對照，培養(yǎng)條件同上，每天觀察和記錄發(fā)病情況，接種3～7 d后計算發(fā)病率和病情指數(shù)。

1.2.4 青枯菌不同生物型對桉樹的致病性測定 利用頂尖接種法分別接種青枯菌生理小種3號生物型Ⅱ Po 88菌株和生物型Ⅲ Po 43菌株的菌懸液，以接種桉樹青枯菌Rrpr和無菌水為對照，方法同上，每天觀察和記錄發(fā)病情況，接種3～7 d后計算發(fā)病率和病情指數(shù)。

1.2.5 病原菌的分離驗證 取接種試驗中發(fā)病的莖段，在超凈工作臺中用70%酒精消毒30 s，升汞消毒2 min，無菌水沖洗3～4次，然后取發(fā)病部位研磨，取上清液200 μL涂布于KB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌體的形態(tài)，與青枯菌做對比，再將對比后的菌株在TTC培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，觀察菌株是否出現(xiàn)因毒力不同而變色的現(xiàn)象，驗證尾葉桉發(fā)病是否由于青枯病菌的侵染所致。

1.2.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 應用Excel 2019軟件對試驗數(shù)據(jù)進行計算和制圖，然后分別對數(shù)據(jù)進行反正弦轉(zhuǎn)換，再使用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析和Duncan多重比較，以此進行數(shù)據(jù)的差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 青枯菌不同生理小種對尾葉桉的致病性

2.1.1 頂尖接種法 以接種無菌水和桉樹青枯病菌Rrpr為對照，使用頂尖接種法對尾葉桉莖段接種不同生理小種的青枯菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種青枯菌生理小種2號菌株GIM 1.76和3號菌株P(guān)o 88的尾葉桉莖段出現(xiàn)了與對照菌株生理小種1號菌株Rrpr相同的癥狀，接種3 d左右莖段頂端長出菌膿，7 d左右莖段由頂端向下逐漸變黑，而接種生理小種4號菌株Z 2013-1和5號GIM 1.73后的莖段與接種對照無菌水的莖段癥狀相同，均未出現(xiàn)桉樹青枯病的典型癥狀。

尾葉桉頂尖接種青枯菌不同生理小種的發(fā)病率結(jié)果見圖1。

圖1 尾葉桉頂尖接種青枯菌不同生理小種的發(fā)病率Figure 1 The disease incidence of E. urophylla by apex inoculation of different physiological races of R. solanacearum注：對同一記錄時間不同青枯菌生理小種的發(fā)病率進行差異性分析，不同小寫字母表示發(fā)病率差異顯著。

由圖1可知，接種青枯菌GIM 1.76和Po 88 3 d、5 d、7 d后莖段的發(fā)病率和對照接種桉樹青枯菌Rrpr后的發(fā)病率均隨接種天數(shù)的增加而增加，且在這3個記錄時間點的莖段發(fā)病率與對照菌株Rrpr相比均無顯著性差異(P>0.05)，但多數(shù)與無菌水對照CK有顯著性差異(P<0.05)，其中接種青枯菌GIM 1.76和Po 88 第7天時桉樹的發(fā)病率分別為60.0%和40.0%，而此時接種對照青枯菌Rrpr后桉樹的發(fā)病率為73.3%。

尾葉桉莖尖接種青枯菌不同生理小種的病情指數(shù)結(jié)果見表2。

表2 尾葉桉莖尖接種青枯菌不同生理小種的病情指數(shù)Table 2 The disease indices of E. urophylla by apex inoculation of different physiological races of R. solanacearum

由表2可知，從病情指數(shù)上看，接種不同青枯菌生理小種7 d后，接種青枯菌菌株GIM 1.76和Po 88的莖段病情指數(shù)均為17.8，與對照菌株Rrpr的病情指數(shù)相比均無顯著差異(P>0.05)。

綜合以上結(jié)果可知，使用頂尖接種法接種青枯菌1～5號生理小種后發(fā)現(xiàn)，青枯菌生理小種2號菌株GIM 1.76和3號菌株P(guān)o 88與對照生理小種1號菌株Rrpr一樣，均對桉樹具有較強的致病能力。

2.1.2 莖段浸泡法 莖段浸泡法接種青枯菌不同生理小種后，接種青枯菌生理小種2號菌株GIM 1.76和3號菌株P(guān)o 88的尾葉桉莖段的發(fā)病癥狀與接種對照菌株Rrpr的癥狀相同，3 d后部分莖段頂端產(chǎn)生菌膿，7 d后由頂端向下變黑；而接種青枯菌Z 2013-1、GIM 1.73和無菌水對照的莖段均無發(fā)病癥狀。

尾葉桉浸泡接種青枯菌不同生理小種的發(fā)病率結(jié)果見圖2。

圖2 尾葉桉浸泡接種青枯菌不同生理小種的發(fā)病率Figure 2 The disease incidence of E. urophylla by soaking inoculation of different physiological races of R. solanacearum注：對同一記錄時間不同青枯菌生理小種的發(fā)病率進行差異性分析，不同小寫字母表示發(fā)病率差異顯著。

由圖2可知，在致病青枯菌生理小種中，使用莖段浸泡法分別接種菌株后桉樹莖段的發(fā)病率均隨著接種時間的增長而增大，其中接種青枯菌GIM 1.76和Po 88 7 d后的發(fā)病率最高，均達到了80.0%，而同等條件下的對照菌株Rrpr的致病率僅為60.0%，但接種青枯菌GIM 1.76和Po 88 3 d、5 d、7 d后桉樹的發(fā)病率與對照菌株Rrpr相比均無顯著差異(P>0.05)，與無菌水對照有顯著性差異(P<0.05)。

尾葉桉浸泡接種青枯菌不同生理小種的病情指數(shù)結(jié)果見表3。

表3 尾葉桉浸泡接種青枯菌不同生理小種的病情指數(shù)Table 3 The disease indices of E. urophylla by soaking inoculation of different physiological races of R. solanacearum

由表3可知，從病情指數(shù)上看，分別接種不同青枯生理小種7 d后，接種菌株GIM 1.76和Po 88的病情指數(shù)均為35.6，與對照菌株Rrpr相比均無顯著差異(P>0.05)。

綜上結(jié)果說明，浸泡接種法接種不同生理小種后發(fā)現(xiàn)，青枯菌生理小種2號菌株GIM 1.76和3號菌株P(guān)o 88與對照菌株Rrpr一樣，對桉樹均具很高的致病風險。

2.2 青枯菌不同生物型對尾葉桉的致病性

頂尖接種法接種青枯菌生理小種3號的不同生物型后，青枯菌生物型Ⅱ菌株P(guān)o 88和生物型Ⅲ菌株P(guān)o 43對尾葉桉莖段均有致病性，且癥狀與對照生物型Ⅲ菌株Rrpr的癥狀相同，3 d左右接種頂端長出菌膿，7 d左右莖段由頂端向下變黑。

尾葉桉頂尖接種青枯菌不同生物型的發(fā)病率結(jié)果見圖3。

圖3 尾葉桉頂尖接種青枯菌不同生物型的發(fā)病率Figure 3 The disease incidence of E. urophylla by apex inoculation of different biotypes of R. solanacearum注：對同一記錄時間不同青枯菌生物型的發(fā)病率進行差異性分析，不同小寫字母表示發(fā)病率差異顯著。

由圖3可知，分別頂尖接種無菌水和桉樹青枯病菌Rrpr兩組對照及兩種青枯菌生物型3 d、5 d、7 d后，除無菌水對照外，桉樹的發(fā)病率均隨著接種天數(shù)的延長而增高，在接種菌株P(guān)o 88和Po 43 7 d后桉樹的發(fā)病率分別為40.0%和80.0%，但均與對照菌株Rrpr相比無顯著性差異(P>0.05)。

尾葉桉頂端接種青枯菌不同生物型的病情指數(shù)結(jié)果見表4。

表4 尾葉桉頂端接種青枯菌不同生物型的病情指數(shù)Table 4 The disease indices of E. urophylla by apex inoculation of different biotypes of R. solanacearum

由表4可知，從病情指數(shù)上看，頂尖接種7 d后，青枯菌Po 88和Po 43的病情指數(shù)均小于對照菌株Rrpr的病情指數(shù)，分別為17.8和33.3，但與對照菌株Rrpr相比均無顯著性差異(P>0.05)。

綜上所述，青枯菌生理小種3號的生物型Ⅱ菌株P(guān)o 88和生物型Ⅲ菌株P(guān)o 43與對照小種1號生物型Ⅲ菌株Rrpr一樣均能引起桉樹發(fā)病，且具有很強的侵染能力。

2.3 致病菌的分離驗證

將接種試驗中發(fā)病莖段組織研磨，取研磨的上清液于KB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，1～2 d后長出菌落，形態(tài)與原菌落形態(tài)一致，且處理組培養(yǎng)出的菌落形態(tài)與對照組的菌落形態(tài)一致，即均與桉樹青枯菌菌落形態(tài)特征相同，驗證了本試驗中尾葉桉莖段的發(fā)病是由于供試青枯菌的侵染引起的。

3 結(jié)論與討論

植物青枯病菌具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性，不同地理起源的青枯菌與寄主協(xié)同進化過程中表現(xiàn)出明顯的生理分化和高度的變異性，對不同的植物也會表現(xiàn)出不同的致病能力，而生理小種就是依據(jù)青枯菌菌株對不同植物的致病能力進行劃分的[7]。目前對于有關(guān)桉樹青枯病菌生理小種和生物型的研究極少，大多是針對于番茄[22]、馬鈴薯[23]和煙草[15,24]等經(jīng)濟作物。本研究運用頂尖接種法和莖段浸泡法分別給健康的尾葉桉莖段接種青枯菌不同生理小種和生物型，以測定其對尾葉桉的致病能力，使用2種方法均得到了相同的結(jié)果，即除桉樹青枯病菌Rrpr外，生理小種2號和3號均能引起尾葉桉發(fā)生桉樹青枯病，且生理小種3號的2個生物型Ⅱ和Ⅲ也能使其發(fā)病。吳光金等對我國桉樹青枯病3個流行區(qū)病菌生理小種和生物型類型進行了鑒定，結(jié)果間接說明了除青枯菌生理小種1號及生物型Ⅲ外，存在部分地區(qū)的生理小種2號和3號及生物型Ⅱ和Ⅴ也能引起桉樹青枯病，與本研究的結(jié)論一致[3]。另外，吳清平和梁子超研究發(fā)現(xiàn)桉樹青枯病菌的一些生理生化反應與番茄、木麻黃、甘薯和花生青枯病菌的相似，且該病菌對柳桉、茄子、花生、煙草、番茄、木麻黃、甘薯和馬鈴薯等青枯菌寄主植物均有不同程度的致病力，同樣表明了某種生理小種或生物型的青枯菌的寄主范圍不單單只有原寄主一種[4]。本研究結(jié)果對桉樹的生產(chǎn)經(jīng)營具有指導性作用，避免在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)交叉侵染。

另外，研究還發(fā)現(xiàn)生理小種3號的生物型Ⅱ和Ⅲ也能使桉樹莖段發(fā)病，而同為生物型Ⅲ的菌株Rrpr[4]和Po 43的致病能力相似，但卻比生物型Ⅱ的Po 88致病能力強，說明了對于桉樹青枯病而言，青枯菌生物型Ⅲ對桉樹的致病能力要強于生物性Ⅱ，這也就解釋了我國目前引起桉樹青枯病菌的生物型主要為Ⅲ，而其他的生物型較少[3]。

然而使用頂尖接種和浸泡接種2種方法所得到的結(jié)果也有差異。使用頂尖接種法所測得的桉樹青枯病菌Rrpr的致病力和病情指數(shù)高于生理小種2號和3號，但莖段浸泡接種所得到的結(jié)果與此相反，而王艷麗測定不同桉樹無性系抗病能力時，所用的頂尖接種法和莖段浸泡法所測得結(jié)果一樣[17]。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與青枯菌的性質(zhì)和基因等有關(guān)，不同類型的青枯菌在植株體內(nèi)的定殖與轉(zhuǎn)運能力存在差異，而本試驗中頂尖接種直接接種在了形態(tài)學上端部位，而浸泡接種則需要青枯菌先定殖于形態(tài)學下端，然后再轉(zhuǎn)運到形態(tài)學上端，這對于生理小種1號而言，可能其在桉樹莖段內(nèi)的定殖與轉(zhuǎn)運能力相較于生理小種2號和3號來說比較弱，所以才出現(xiàn)了這種現(xiàn)象；還有一種可能是生理小種1號與生理小種2號和3號相比，對幼嫩植物的致病能力更強，發(fā)病時間更快，也許在浸泡接種7 d后會出現(xiàn)與頂尖接種一樣的結(jié)果。目前對于這2種方法所引起的差異，尚無明確的試驗和理論支持，欲究其原因可做進一步的研究，探究出更佳的接種方法。

致謝：感謝華中農(nóng)業(yè)大學的陳惠蘭老師和中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所的徐進老師為本研究提供了不同生理小種和生物型的青枯菌。