龐丁瑋，王軍,原陽晨,于海濤,左樹峰,王進(jìn)茂

(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000； 2 河北霧靈山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理中心，河北 興隆 067300； 3 河北省洪崖山國有林場管理局，河北 易縣 074200)

對(duì)植物進(jìn)行分類是研究植物不同類群起源、親緣關(guān)系及其進(jìn)化規(guī)律的第一步[1]。葉片作為植物最重要的器官之一，是植物進(jìn)行光合及蒸騰作用的主要場所，其多樣性極為豐富且易采集，可以分為葉尖、葉基、葉緣等部分，故常作為植物分類最直接的依據(jù)[2]。最傳統(tǒng)的植物分類方法是通過形態(tài)學(xué)觀察和手工測量，這種方法容易使人陷入主觀判斷，缺乏準(zhǔn)確性和精度[3]。

近年來，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的逐漸成熟，利用圖像處理與識(shí)別對(duì)葉形進(jìn)行分析的方法得到了廣泛應(yīng)用。劉驥等使用閾值分割對(duì)葉片進(jìn)行二值化處理，從二值圖像上提取了 8 種描述葉片形狀的特征，實(shí)現(xiàn)了15種植物葉片識(shí)別[4]。王麗君等在形狀、紋理特征的基礎(chǔ)上提取了葉片圖像的顏色，對(duì)50種觀葉植物葉片圖像進(jìn)行識(shí)別，識(shí)別率達(dá)到了91.41%[5]。Bylesjo M等開發(fā)了一種用于自動(dòng)分析葉片圖像的新工具 Lamina 軟件，經(jīng)處理后可有效測量葉面積、葉周長等葉片性狀[6]。上述研究均是在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上利用計(jì)算機(jī)輔助對(duì)葉片進(jìn)行的識(shí)別，大多分為葉片圖像獲取、對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理、閾值分割及葉片特征參數(shù)的提取幾個(gè)步驟，在一定程度上可以實(shí)現(xiàn)對(duì)植物葉片的快速識(shí)別。但是，上述方法依然存在一些不足：一是葉形變異較難量化，僅通過數(shù)量形態(tài)性狀不能直觀描述葉片形態(tài)的變異[7]；二是辨別形狀的能力不足，不同形態(tài)可能得出相同的距離數(shù)據(jù)，如卵圓形葉片和扇形葉片形狀雖不同，但其最大長度和最大寬度數(shù)據(jù)可能會(huì)相同；三是很多距離不能作為同源性狀，故其同源性較難評(píng)估[8]。

幾何形態(tài)學(xué)的出現(xiàn)，使數(shù)據(jù)的獲取及分析更為容易，也為定量分析葉形形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異提供了可能。其分析方法通過將研究對(duì)象的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為笛卡爾坐標(biāo)，并剔除形態(tài)差異的大小、方位及物理因素的影響，只保留形狀因素，使辨別樣本間個(gè)體差異更加精確[9]。由于其具有操作簡便、分類效果更加直觀、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于形態(tài)變異的研究上。如宋佳等介紹了基于葉片標(biāo)志點(diǎn)的Morpho J 軟件對(duì)葉片形態(tài)進(jìn)行分析的方法[10]；劉媛等通過對(duì)槲樹和槲櫟2個(gè)近緣種葉片形態(tài)進(jìn)行研究，探討并總結(jié)了幾何形態(tài)測量方法在植物中的應(yīng)用[11]；王長海等基于Leaf Analyser 和MorphoJ 軟件的測量，以可視化的形式闡明小葉楊及歐洲黑楊葉片形態(tài)的變異[7]；Viscosi等對(duì)歐洲4個(gè)櫟樹近緣種進(jìn)行幾何形態(tài)學(xué)分析，找出了其葉形變化與環(huán)境因素的關(guān)系[12]。

研究經(jīng)掃描獲得“冀洪1號(hào)”黑棗及普通黑棗的葉片圖像，并使用Lamina軟件對(duì)葉面積、葉片周長、葉長、葉寬2個(gè)形態(tài)性狀進(jìn)行測定，使用 Image J軟件對(duì)葉片的標(biāo)志點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)定，使用MorphoJ 軟件對(duì)2品種黑棗葉形變異進(jìn)行分析，通過2種方法相結(jié)合，進(jìn)而為深入研究“冀洪1號(hào)”黑棗與普通黑棗的親緣關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究對(duì)象為“冀洪1號(hào)”黑棗葉片與普通黑棗葉片，采集于河北省保定市唐縣楊家庵村和易縣豹泉林場，共計(jì)25株，對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，其中“冀洪1號(hào)”黑棗起源于當(dāng)?shù)剞r(nóng)家品種，樣本采集自當(dāng)?shù)貥潺g超過50 a的大樹，共7株，普通黑棗為自然實(shí)生品種，共18株，個(gè)體之間至少相隔50 m。隨機(jī)摘取同一無性系生長位置相同(頂端向下第3片葉)，均勻一致，無病蟲害及明顯缺陷的成熟葉片，20片為1組，摘取3組，共60片。葉片摘下后用密封袋進(jìn)行保存，運(yùn)送至河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室用于后續(xù)形態(tài)學(xué)分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉片圖像獲取 將葉片用標(biāo)本夾壓平，待其干燥后用CanScan5600F掃描儀進(jìn)行掃描，分辨率設(shè)置為600 dpi，輸出格式為圖片(.jpg)格式。

1.2.2 葉片性狀測定及分析 使用葉形分析軟件Lamina分析葉形指標(biāo)，包括葉面積、葉周長、葉長和葉寬。采用EXCEL軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和初步統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和變異系數(shù)分析。變異系數(shù)(C.V)計(jì)算公式如下：

其中SD為標(biāo)準(zhǔn)差，M為均值。

1.2.3 葉片形態(tài)變異分析

1.2.3.1 標(biāo)志點(diǎn)的獲取 葉片標(biāo)志點(diǎn)位置及描述詳見圖1，表1。

圖1 標(biāo)志點(diǎn)位置Figure 1 Location of the mark point

表1 黑棗葉片標(biāo)志點(diǎn)描述Table 1 Description of leaf marker points of Diospyros lotus L.

通過Image J[13]對(duì)掃描圖像進(jìn)行數(shù)字化處理，分別選取13個(gè)“冀洪1號(hào)”黑棗和普通黑棗葉片的標(biāo)志點(diǎn)，包括沿主脈分布的3個(gè)標(biāo)志點(diǎn)(1-3)及對(duì)稱結(jié)構(gòu)的10個(gè)標(biāo)志點(diǎn)(4-13)，這些標(biāo)志點(diǎn)將被轉(zhuǎn)化為每個(gè)葉片的13對(duì)坐標(biāo)(x，y)，并用文本文檔的格式進(jìn)行保存，用于后續(xù)的分析研究。

1.2.3.2 數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理 利用Morpho J軟件進(jìn)行后續(xù)的分析[14]。首先，使用普氏疊印法(GPA)對(duì)獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由所有葉片的坐標(biāo)數(shù)據(jù)組成一個(gè)三維數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)該矩陣，對(duì)葉片各標(biāo)志點(diǎn)的位置、尺寸及方向等非形狀因素進(jìn)行平移、旋轉(zhuǎn)、鏡像等操作，生成對(duì)應(yīng)坐標(biāo)之間差異極小的平均葉形，并提取葉片形狀信息進(jìn)行偏差檢測，挑出離群值，在排除偏離群體較大的數(shù)值之后，進(jìn)行數(shù)據(jù)提取和重新分類[1]。

1.2.3.3 統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)疊印后的葉片形態(tài)坐標(biāo)進(jìn)行Procustes分析，生成協(xié)方差矩陣，基于此進(jìn)行主成分分析(PCA)，找出葉片形態(tài)變異的主要特征；在此基礎(chǔ)上對(duì)黑棗葉片形態(tài)學(xué)差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，通過判別分析(DA)來討論兩品種黑棗之間的差異，相關(guān)結(jié)果以馬氏距離(Mahalanobis distance)及普氏距離(Procrustes distance)展現(xiàn)出來。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片性狀方差分析

對(duì)所測樣本進(jìn)行方差分析，詳見表2。

表2 黑棗葉形性狀方差分析Table 2 Variance analysis of leaf shape traits of Diospyros lotus L.

由表2可知，“冀洪1號(hào)”黑棗在葉寬上極顯著高于普通黑棗，超出普通黑棗 18.89%，在葉面積、葉周長上顯著高于普通黑棗，超出普通黑棗32.46%和15.25%。在葉長上，“冀洪1號(hào)”黑棗略高于普通黑棗，但未達(dá)到顯著差異。“冀洪1號(hào)”黑棗4個(gè)性狀變異系數(shù)均小于普通黑棗，性狀變化幅度較小。

2.2 葉形變異的主成分分析

2黑棗品種葉片形態(tài)的主要變異規(guī)律見表3。黑棗葉片第一、第二主成分散點(diǎn)圖及網(wǎng)格輪廓圖見圖2。

表3 葉片主成分分析Table 3 Principal component analysis of leaves

圖2 黑棗葉片第一主成分和第二主成分的散點(diǎn)圖及網(wǎng)格輪廓圖Figure 2 The scatter plots of PC1 and PC2 for leaves and outline variation of Diospyros lotus L.注：A: PC1軸的值為0.14時(shí)的葉片平均形態(tài)；B: PC1軸的值為-0.14時(shí)的葉片平均形態(tài)；C: PC2軸的值為-0.09時(shí)的葉片平均形態(tài)；D: PC2軸的值為0.14時(shí)的葉片平均形態(tài)

根據(jù)Morpho J軟件對(duì)黑棗葉片標(biāo)志點(diǎn)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)共占總體變量的63.447%(分別為50.537%和12.910%)，而前5個(gè)主成分(PC)共占葉片形態(tài)變化的85.044%，能夠說明兩黑棗品種葉片形態(tài)的主要變異規(guī)律。對(duì)第一和第二主成分作散點(diǎn)圖可知，在PCA二維分布散點(diǎn)圖中，“冀洪1號(hào)”黑棗與普通黑棗重疊區(qū)域較多，沒有形成2個(gè)明顯不同類群，但兩黑棗品種葉片均較分散，這表明無論是品種間還是品種內(nèi)都出現(xiàn)了一定程度的變異。

2.3 薄板樣條法分析

基于薄板樣條變形的矩形網(wǎng)格圖可將葉片的位置信息在形態(tài)空間以可視化形式展現(xiàn)。其中的深藍(lán)色線條代表對(duì)應(yīng)的標(biāo)志點(diǎn)與葉片平均形態(tài)(帶數(shù)字的藍(lán)點(diǎn))之間的差異，線條的長度代表對(duì)應(yīng)標(biāo)志點(diǎn)的變化幅度，淺藍(lán)色網(wǎng)格的彎曲代表葉片擴(kuò)張和收縮的變化趨勢。在同一比例下截取“冀洪1號(hào)”黑棗與普通黑棗植物掃描葉片對(duì)比見圖3。

圖3 “冀洪1號(hào)”黑棗與普通黑棗植物葉片對(duì)比圖Figure 3 Comparison of leaves between "Jihong No.1" and ordinary Diospyros lotus L. plants

結(jié)合圖2中網(wǎng)格輪廓的扭曲幅度可知，在PC1軸的負(fù)方向上，“冀洪1號(hào)”黑棗葉片具有較短的葉柄及較寬的葉片，為寬卵圓形，表現(xiàn)為標(biāo)志點(diǎn)1,2向上收縮，同時(shí)葉片左右最寬處端點(diǎn)5,4的深藍(lán)色線條指向相反的方向，并且向相反方向延長；而處于PC1正半軸方向上的普通黑棗葉片則表現(xiàn)出相反的趨勢，具有較窄的葉片且葉柄較長，為窄卵圓形。在PC2軸上，葉片的變異主要發(fā)生在葉片最寬處(標(biāo)點(diǎn)4和5)在左右兩側(cè)分布時(shí)的相對(duì)位置。從PC2的負(fù)值可以看出，以葉片正部為正面，“冀洪1號(hào)”黑棗葉片的左側(cè)最大寬度處(標(biāo)點(diǎn)5)向上延伸，較葉片右側(cè)最大寬度處(標(biāo)點(diǎn)4)更靠近葉片尖部，PC2正軸方向則相反。

2.4 “冀洪1號(hào)”黑棗與普通黑棗間的判別分析

判別分析(DA)是指在確定分類的情況下，根據(jù)其特征值對(duì)個(gè)體層次的物種進(jìn)行鑒定的一種方法，通常用于分析數(shù)據(jù)為2個(gè)類群時(shí)，進(jìn)行兩兩之間的比較[16]。

葉形判別分析結(jié)果見圖4。

圖4 葉形判別分析結(jié)果Figure 4 Results of leaf shape discriminant analysis

根據(jù)判別函數(shù)方法分析得出的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，2品種間馬氏距離(Mahalanobis distance)為1.790，普氏距離(Procrustes distance)為0.100，在差異顯著性方面，兩者之間無顯著性差異(P>0.05)。

DA分析通過對(duì)其結(jié)果進(jìn)行基于10 000次重復(fù)的P值檢驗(yàn)， “冀洪1號(hào)”黑棗與普通黑棗重疊的部分較多。僅有62.5%的“冀洪1號(hào)”黑棗與64.7%的普通黑棗被準(zhǔn)確的區(qū)分開，且“冀洪1號(hào)”黑棗與普通黑棗之間的T2為48.45，并不顯著(P>0.05)。

3 討論

由于葉片表型性狀易識(shí)別及獲得，故其表型性狀多樣性研究一直作為遺傳多樣性研究最重要的性狀之一。通過對(duì)“冀洪1號(hào)”黑棗及普通黑棗的4個(gè)葉形性狀進(jìn)行方差及顯著性分析，結(jié)果表明：“冀洪1號(hào)”黑棗與普通黑棗的葉形性狀存在較大的種間差異，“冀洪1號(hào)”黑棗的葉片較大，但其變異幅度較小。可能是因?yàn)椤凹胶?號(hào)”黑棗是無性系，個(gè)體之間出現(xiàn)的差異是環(huán)境因素及控制不同葉片基因表達(dá)的差異反應(yīng)；而普通黑棗是實(shí)生苗，還包括個(gè)體基因型的差異，所以導(dǎo)致“冀洪1號(hào)”黑棗的變異幅度小于普通黑棗。此傳統(tǒng)測量方法能夠結(jié)合形態(tài)性狀的數(shù)值化和多變量統(tǒng)計(jì)，但葉片形態(tài)數(shù)據(jù)難以準(zhǔn)確量化，僅能測量葉面積、葉周長、葉長、葉寬等數(shù)量性狀，形態(tài)信息不完整且不直觀，而幾何形態(tài)測量學(xué)技術(shù)能排除葉片大小的影響，對(duì)葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行量化分析，通過計(jì)算葉片標(biāo)點(diǎn)之間的距離，借助一系列統(tǒng)計(jì)方法，提供更加精細(xì)的形態(tài)變異信息，這不僅給近緣種分類提供了一個(gè)新方法，也為葉形的研究提供了新思路。

研究利用幾何形態(tài)方法對(duì)黑棗的2個(gè)品種葉片形態(tài)特征進(jìn)行比較及判別分析，從葉片主成分分析散點(diǎn)圖及薄板樣條分析結(jié)果可以看出，“冀洪1號(hào)”黑棗與普通黑棗形態(tài)相似，僅在葉柄及葉片最大寬度處有微小差異?？赡苁且?yàn)椤凹胶?號(hào)”黑棗是通過普通黑棗實(shí)生群體中選擇優(yōu)株，無性繁殖形成的新品種，對(duì)當(dāng)?shù)貧夂蚣巴寥赖拳h(huán)境因素均存在一定適應(yīng)性， 故存在一定的相似性。而根據(jù)判別分析的分類結(jié)果顯示，“冀洪1號(hào)”黑棗與普通黑棗之間均有誤判發(fā)生，說明對(duì)于形狀相近葉片，判別分析準(zhǔn)確率并不能達(dá)到100%[17]。通過對(duì)“冀洪1號(hào)”黑棗與普通黑棗葉片進(jìn)行比較，能夠找出葉片間的微小差別，并且對(duì)發(fā)現(xiàn)葉形變異與植物遺傳進(jìn)化的關(guān)系有積極作用。

目前，幾何形態(tài)學(xué)分析已經(jīng)在脊椎動(dòng)物學(xué)、昆蟲學(xué)等其他領(lǐng)域取得了較廣泛的應(yīng)用，而在植物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較少。通過幾何形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)、生態(tài)學(xué)等相結(jié)合，研究葉片表型變異，對(duì)于種間、種內(nèi)分類鑒定、遺傳育種、系統(tǒng)進(jìn)化等方面有重要作用[18-20]。如曾衛(wèi)東采集了27個(gè)星果草屬植物居群的植物標(biāo)本，經(jīng)幾何形態(tài)學(xué)、分子系統(tǒng)學(xué)及生態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，星果草與裂葉星果草不支持成立2個(gè)獨(dú)立物種[3]；Wei等利用分子與形態(tài)數(shù)據(jù)相結(jié)合的方式，研究了極易混淆的遼東櫟和蒙古櫟在形態(tài)性狀的變異，揭示了雜交率對(duì)形態(tài)性狀和分類學(xué)界限的影響[21]。

黑棗具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，是農(nóng)民致富的主要經(jīng)濟(jì)樹種之一，因此，通過傳統(tǒng)方法與幾何形態(tài)測量技術(shù)相結(jié)合的方式對(duì)其進(jìn)行研究，能夠初步探討黑棗種間親緣關(guān)系和葉片形態(tài)差異，使其發(fā)揮更大的應(yīng)用價(jià)值。但任何方法均存在局限性，如植物形態(tài)相近時(shí)，存在誤判情況發(fā)生；進(jìn)行標(biāo)點(diǎn)時(shí)，可能存在人為誤差；植物葉片易受基因型及環(huán)境因素影響等情況發(fā)生。因此，需對(duì)其進(jìn)行多角度研究，才能更好揭示其遺傳多樣性及表型變異的規(guī)律，為其保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。