龐丁瑋，王軍,原陽晨,于海濤,左樹峰,王進茂

(1 河北農(nóng)業(yè)大學 林學院，河北 保定 071000； 2 河北霧靈山國家級自然保護區(qū)管理中心，河北 興隆 067300； 3 河北省洪崖山國有林場管理局，河北 易縣 074200)

對植物進行分類是研究植物不同類群起源、親緣關系及其進化規(guī)律的第一步[1]。葉片作為植物最重要的器官之一，是植物進行光合及蒸騰作用的主要場所，其多樣性極為豐富且易采集，可以分為葉尖、葉基、葉緣等部分，故常作為植物分類最直接的依據(jù)[2]。最傳統(tǒng)的植物分類方法是通過形態(tài)學觀察和手工測量，這種方法容易使人陷入主觀判斷，缺乏準確性和精度[3]。

近年來，隨著計算機技術的逐漸成熟，利用圖像處理與識別對葉形進行分析的方法得到了廣泛應用。劉驥等使用閾值分割對葉片進行二值化處理，從二值圖像上提取了 8 種描述葉片形狀的特征，實現(xiàn)了15種植物葉片識別[4]。王麗君等在形狀、紋理特征的基礎上提取了葉片圖像的顏色，對50種觀葉植物葉片圖像進行識別，識別率達到了91.41%[5]。Bylesjo M等開發(fā)了一種用于自動分析葉片圖像的新工具 Lamina 軟件，經(jīng)處理后可有效測量葉面積、葉周長等葉片性狀[6]。上述研究均是在傳統(tǒng)方法基礎上利用計算機輔助對葉片進行的識別，大多分為葉片圖像獲取、對圖像進行預處理、閾值分割及葉片特征參數(shù)的提取幾個步驟，在一定程度上可以實現(xiàn)對植物葉片的快速識別。但是，上述方法依然存在一些不足：一是葉形變異較難量化，僅通過數(shù)量形態(tài)性狀不能直觀描述葉片形態(tài)的變異[7]；二是辨別形狀的能力不足，不同形態(tài)可能得出相同的距離數(shù)據(jù)，如卵圓形葉片和扇形葉片形狀雖不同，但其最大長度和最大寬度數(shù)據(jù)可能會相同；三是很多距離不能作為同源性狀，故其同源性較難評估[8]。

幾何形態(tài)學的出現(xiàn)，使數(shù)據(jù)的獲取及分析更為容易，也為定量分析葉形形態(tài)結構的差異提供了可能。其分析方法通過將研究對象的結構轉(zhuǎn)化為笛卡爾坐標，并剔除形態(tài)差異的大小、方位及物理因素的影響，只保留形狀因素，使辨別樣本間個體差異更加精確[9]。由于其具有操作簡便、分類效果更加直觀、重復性高等優(yōu)點，因此被廣泛應用于形態(tài)變異的研究上。如宋佳等介紹了基于葉片標志點的Morpho J 軟件對葉片形態(tài)進行分析的方法[10]；劉媛等通過對槲樹和槲櫟2個近緣種葉片形態(tài)進行研究，探討并總結了幾何形態(tài)測量方法在植物中的應用[11]；王長海等基于Leaf Analyser 和MorphoJ 軟件的測量，以可視化的形式闡明小葉楊及歐洲黑楊葉片形態(tài)的變異[7]；Viscosi等對歐洲4個櫟樹近緣種進行幾何形態(tài)學分析，找出了其葉形變化與環(huán)境因素的關系[12]。

研究經(jīng)掃描獲得“冀洪1號”黑棗及普通黑棗的葉片圖像，并使用Lamina軟件對葉面積、葉片周長、葉長、葉寬2個形態(tài)性狀進行測定，使用 Image J軟件對葉片的標志點進行標定，使用MorphoJ 軟件對2品種黑棗葉形變異進行分析，通過2種方法相結合，進而為深入研究“冀洪1號”黑棗與普通黑棗的親緣關系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究對象為“冀洪1號”黑棗葉片與普通黑棗葉片，采集于河北省保定市唐縣楊家庵村和易縣豹泉林場，共計25株，對其進行編號，其中“冀洪1號”黑棗起源于當?shù)剞r(nóng)家品種，樣本采集自當?shù)貥潺g超過50 a的大樹，共7株，普通黑棗為自然實生品種，共18株，個體之間至少相隔50 m。隨機摘取同一無性系生長位置相同(頂端向下第3片葉)，均勻一致，無病蟲害及明顯缺陷的成熟葉片，20片為1組，摘取3組，共60片。葉片摘下后用密封袋進行保存，運送至河北農(nóng)業(yè)大學林木遺傳育種實驗室用于后續(xù)形態(tài)學分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉片圖像獲取 將葉片用標本夾壓平，待其干燥后用CanScan5600F掃描儀進行掃描，分辨率設置為600 dpi，輸出格式為圖片(.jpg)格式。

1.2.2 葉片性狀測定及分析 使用葉形分析軟件Lamina分析葉形指標，包括葉面積、葉周長、葉長和葉寬。采用EXCEL軟件對數(shù)據(jù)進行整理和初步統(tǒng)計，采用SPSS 19.0進行方差分析和變異系數(shù)分析。變異系數(shù)(C.V)計算公式如下：

其中SD為標準差，M為均值。

1.2.3 葉片形態(tài)變異分析

1.2.3.1 標志點的獲取 葉片標志點位置及描述詳見圖1，表1。

圖1 標志點位置Figure 1 Location of the mark point

表1 黑棗葉片標志點描述Table 1 Description of leaf marker points of Diospyros lotus L.

通過Image J[13]對掃描圖像進行數(shù)字化處理，分別選取13個“冀洪1號”黑棗和普通黑棗葉片的標志點，包括沿主脈分布的3個標志點(1-3)及對稱結構的10個標志點(4-13)，這些標志點將被轉(zhuǎn)化為每個葉片的13對坐標(x，y)，并用文本文檔的格式進行保存，用于后續(xù)的分析研究。

1.2.3.2 數(shù)據(jù)的標準化處理 利用Morpho J軟件進行后續(xù)的分析[14]。首先，使用普氏疊印法(GPA)對獲取的數(shù)據(jù)進行分析，由所有葉片的坐標數(shù)據(jù)組成一個三維數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)該矩陣，對葉片各標志點的位置、尺寸及方向等非形狀因素進行平移、旋轉(zhuǎn)、鏡像等操作，生成對應坐標之間差異極小的平均葉形，并提取葉片形狀信息進行偏差檢測，挑出離群值，在排除偏離群體較大的數(shù)值之后，進行數(shù)據(jù)提取和重新分類[1]。

1.2.3.3 統(tǒng)計分析 對疊印后的葉片形態(tài)坐標進行Procustes分析，生成協(xié)方差矩陣，基于此進行主成分分析(PCA)，找出葉片形態(tài)變異的主要特征；在此基礎上對黑棗葉片形態(tài)學差異進行統(tǒng)計學檢驗，通過判別分析(DA)來討論兩品種黑棗之間的差異，相關結果以馬氏距離(Mahalanobis distance)及普氏距離(Procrustes distance)展現(xiàn)出來。

2 結果與分析

2.1 葉片性狀方差分析

對所測樣本進行方差分析，詳見表2。

表2 黑棗葉形性狀方差分析Table 2 Variance analysis of leaf shape traits of Diospyros lotus L.

由表2可知，“冀洪1號”黑棗在葉寬上極顯著高于普通黑棗，超出普通黑棗 18.89%，在葉面積、葉周長上顯著高于普通黑棗，超出普通黑棗32.46%和15.25%。在葉長上，“冀洪1號”黑棗略高于普通黑棗，但未達到顯著差異?！凹胶?號”黑棗4個性狀變異系數(shù)均小于普通黑棗，性狀變化幅度較小。

2.2 葉形變異的主成分分析

2黑棗品種葉片形態(tài)的主要變異規(guī)律見表3。黑棗葉片第一、第二主成分散點圖及網(wǎng)格輪廓圖見圖2。

表3 葉片主成分分析Table 3 Principal component analysis of leaves

圖2 黑棗葉片第一主成分和第二主成分的散點圖及網(wǎng)格輪廓圖Figure 2 The scatter plots of PC1 and PC2 for leaves and outline variation of Diospyros lotus L.注：A: PC1軸的值為0.14時的葉片平均形態(tài)；B: PC1軸的值為-0.14時的葉片平均形態(tài)；C: PC2軸的值為-0.09時的葉片平均形態(tài)；D: PC2軸的值為0.14時的葉片平均形態(tài)

根據(jù)Morpho J軟件對黑棗葉片標志點進行主成分分析，結果顯示，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)共占總體變量的63.447%(分別為50.537%和12.910%)，而前5個主成分(PC)共占葉片形態(tài)變化的85.044%，能夠說明兩黑棗品種葉片形態(tài)的主要變異規(guī)律。對第一和第二主成分作散點圖可知，在PCA二維分布散點圖中，“冀洪1號”黑棗與普通黑棗重疊區(qū)域較多，沒有形成2個明顯不同類群，但兩黑棗品種葉片均較分散，這表明無論是品種間還是品種內(nèi)都出現(xiàn)了一定程度的變異。

2.3 薄板樣條法分析

基于薄板樣條變形的矩形網(wǎng)格圖可將葉片的位置信息在形態(tài)空間以可視化形式展現(xiàn)。其中的深藍色線條代表對應的標志點與葉片平均形態(tài)(帶數(shù)字的藍點)之間的差異，線條的長度代表對應標志點的變化幅度，淺藍色網(wǎng)格的彎曲代表葉片擴張和收縮的變化趨勢。在同一比例下截取“冀洪1號”黑棗與普通黑棗植物掃描葉片對比見圖3。

圖3 “冀洪1號”黑棗與普通黑棗植物葉片對比圖Figure 3 Comparison of leaves between "Jihong No.1" and ordinary Diospyros lotus L. plants

結合圖2中網(wǎng)格輪廓的扭曲幅度可知，在PC1軸的負方向上，“冀洪1號”黑棗葉片具有較短的葉柄及較寬的葉片，為寬卵圓形，表現(xiàn)為標志點1,2向上收縮，同時葉片左右最寬處端點5,4的深藍色線條指向相反的方向，并且向相反方向延長；而處于PC1正半軸方向上的普通黑棗葉片則表現(xiàn)出相反的趨勢，具有較窄的葉片且葉柄較長，為窄卵圓形。在PC2軸上，葉片的變異主要發(fā)生在葉片最寬處(標點4和5)在左右兩側(cè)分布時的相對位置。從PC2的負值可以看出，以葉片正部為正面，“冀洪1號”黑棗葉片的左側(cè)最大寬度處(標點5)向上延伸，較葉片右側(cè)最大寬度處(標點4)更靠近葉片尖部，PC2正軸方向則相反。

2.4 “冀洪1號”黑棗與普通黑棗間的判別分析

判別分析(DA)是指在確定分類的情況下，根據(jù)其特征值對個體層次的物種進行鑒定的一種方法，通常用于分析數(shù)據(jù)為2個類群時，進行兩兩之間的比較[16]。

葉形判別分析結果見圖4。

圖4 葉形判別分析結果Figure 4 Results of leaf shape discriminant analysis

根據(jù)判別函數(shù)方法分析得出的統(tǒng)計結果表明，2品種間馬氏距離(Mahalanobis distance)為1.790，普氏距離(Procrustes distance)為0.100，在差異顯著性方面，兩者之間無顯著性差異(P>0.05)。

DA分析通過對其結果進行基于10 000次重復的P值檢驗， “冀洪1號”黑棗與普通黑棗重疊的部分較多。僅有62.5%的“冀洪1號”黑棗與64.7%的普通黑棗被準確的區(qū)分開，且“冀洪1號”黑棗與普通黑棗之間的T2為48.45，并不顯著(P>0.05)。

3 討論

由于葉片表型性狀易識別及獲得，故其表型性狀多樣性研究一直作為遺傳多樣性研究最重要的性狀之一。通過對“冀洪1號”黑棗及普通黑棗的4個葉形性狀進行方差及顯著性分析，結果表明：“冀洪1號”黑棗與普通黑棗的葉形性狀存在較大的種間差異，“冀洪1號”黑棗的葉片較大，但其變異幅度較小?？赡苁且驗椤凹胶?號”黑棗是無性系，個體之間出現(xiàn)的差異是環(huán)境因素及控制不同葉片基因表達的差異反應；而普通黑棗是實生苗，還包括個體基因型的差異，所以導致“冀洪1號”黑棗的變異幅度小于普通黑棗。此傳統(tǒng)測量方法能夠結合形態(tài)性狀的數(shù)值化和多變量統(tǒng)計，但葉片形態(tài)數(shù)據(jù)難以準確量化，僅能測量葉面積、葉周長、葉長、葉寬等數(shù)量性狀，形態(tài)信息不完整且不直觀，而幾何形態(tài)測量學技術能排除葉片大小的影響，對葉片形態(tài)結構進行量化分析，通過計算葉片標點之間的距離，借助一系列統(tǒng)計方法，提供更加精細的形態(tài)變異信息，這不僅給近緣種分類提供了一個新方法，也為葉形的研究提供了新思路。

研究利用幾何形態(tài)方法對黑棗的2個品種葉片形態(tài)特征進行比較及判別分析，從葉片主成分分析散點圖及薄板樣條分析結果可以看出，“冀洪1號”黑棗與普通黑棗形態(tài)相似，僅在葉柄及葉片最大寬度處有微小差異?？赡苁且驗椤凹胶?號”黑棗是通過普通黑棗實生群體中選擇優(yōu)株，無性繁殖形成的新品種，對當?shù)貧夂蚣巴寥赖拳h(huán)境因素均存在一定適應性， 故存在一定的相似性。而根據(jù)判別分析的分類結果顯示，“冀洪1號”黑棗與普通黑棗之間均有誤判發(fā)生，說明對于形狀相近葉片，判別分析準確率并不能達到100%[17]。通過對“冀洪1號”黑棗與普通黑棗葉片進行比較，能夠找出葉片間的微小差別，并且對發(fā)現(xiàn)葉形變異與植物遺傳進化的關系有積極作用。

目前，幾何形態(tài)學分析已經(jīng)在脊椎動物學、昆蟲學等其他領域取得了較廣泛的應用，而在植物學領域應用較少。通過幾何形態(tài)學與分子生物學、生態(tài)學等相結合，研究葉片表型變異，對于種間、種內(nèi)分類鑒定、遺傳育種、系統(tǒng)進化等方面有重要作用[18-20]。如曾衛(wèi)東采集了27個星果草屬植物居群的植物標本，經(jīng)幾何形態(tài)學、分子系統(tǒng)學及生態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，星果草與裂葉星果草不支持成立2個獨立物種[3]；Wei等利用分子與形態(tài)數(shù)據(jù)相結合的方式，研究了極易混淆的遼東櫟和蒙古櫟在形態(tài)性狀的變異，揭示了雜交率對形態(tài)性狀和分類學界限的影響[21]。

黑棗具有極高的營養(yǎng)價值，是農(nóng)民致富的主要經(jīng)濟樹種之一，因此，通過傳統(tǒng)方法與幾何形態(tài)測量技術相結合的方式對其進行研究，能夠初步探討黑棗種間親緣關系和葉片形態(tài)差異，使其發(fā)揮更大的應用價值。但任何方法均存在局限性，如植物形態(tài)相近時，存在誤判情況發(fā)生；進行標點時，可能存在人為誤差；植物葉片易受基因型及環(huán)境因素影響等情況發(fā)生。因此，需對其進行多角度研究，才能更好揭示其遺傳多樣性及表型變異的規(guī)律，為其保護和利用提供科學依據(jù)。