任敏華，張靜燕，崔曉東，陳榮華，劉瓊光,3

(1 華南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，廣東 廣州 510642； 2 贛州市農(nóng)業(yè)科學研究所，江西 贛州 341000；3 廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東 廣州 510642)

茄科雷爾氏菌Ralstonia solanacearum俗稱青枯菌，是危害嚴重的世界性植物病原細菌[1]，廣泛分布于熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)，寄主范圍極廣[2]。青枯菌侵染番茄引起的番茄青枯病，在我國南方番茄產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴重[3-4]。

青枯菌具有高度變異性及適應(yīng)性，菌系分化明顯，不同菌株間基因組變異性較強。明確不同來源青枯菌的致病力分化，探索青枯菌的種內(nèi)遺傳多樣性，具有重要意義。關(guān)于青枯菌的種下分類，Hayward等[5]、華靜月等[6]根據(jù)3種雙糖和3種己醇的利用能力不同，劃分出5個生化變種或生化型。Prior等[7]根據(jù)地理起源的密切相關(guān)性，將青枯菌分為4個演化型，即亞洲分支演化型(Ⅰ)、美洲分支演化型(Ⅱ)、非洲分支演化型(Ⅲ)和印度尼西亞分支演化型(Ⅳ)，而在演化型內(nèi)根據(jù)內(nèi)切葡聚糖酶(Endoglucanase)基因egl序列的差異，又細分為多個序列變種(Sequevar)。目前，國際上已經(jīng)鑒定出51個序列變種，來自中國的青枯菌屬于演化型Ⅰ和Ⅱ，以及 1、12、13、14、15、16、17、18、34、44和48等11個序列變種[8]。盡管我國有些省份對番茄青枯病菌有研究報道[9]，但來自江西省的番茄青枯菌菌系研究較少。

近年來，在江西省贛南地區(qū)種植番茄、辣椒和茄子等茄科蔬菜面積擴大，發(fā)展態(tài)勢迅猛，然而，由于青枯病的嚴重危害，給當?shù)厥卟松a(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，番茄青枯病的防治尚無有效的防治藥劑，雖然有研究表明選擇合適的噬菌體或噬菌體組合對作物青枯病具有較好的防治作用[10-12]，但其應(yīng)用仍受到許多限制。選育抗病或耐病品種是青枯病防治最經(jīng)濟有效的方法，但由于青枯菌菌系分化明顯，且與寄主、環(huán)境之間構(gòu)成復(fù)雜的互作關(guān)系，使得生產(chǎn)上推廣的抗病品種往往隨著種植年限的延長、青枯菌菌系致病力的變化，導(dǎo)致品種的抗性喪失[13-15]，因此，抗病育種工作任務(wù)艱巨。分離贛南地區(qū)的番茄青枯菌菌株，建立該地區(qū)青枯菌資源庫，明確青枯菌的生化變種、致病力、序列變種以及對噬菌體的敏感性，將有助于解析青枯病的發(fā)生流行機理、指導(dǎo)番茄抗青枯病育種和制定相關(guān)的病害防治措施。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基及噬菌體

固體培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g·L-1，酵母膏 3 g·L-1，蛋白胨 3 g·L-1，硫酸鎂 0.25 g·L-1，磷酸氫二鉀 2 g·L-1，磷酸二氫鉀 0.5 g·L-1，蔗糖 15 g·L-1，瓊脂粉 18 g·L-1。

半固體培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g·L-1，酵母膏 3 g·L-1，蛋白胨 3 g·L-1，硫酸鎂 0.25 g·L-1，磷酸氫二鉀 2 g·L-1，磷酸二氫鉀 0.5 g·L-1，蔗糖 15 g·L-1，瓊脂粉 8 g·L-1。

LB 液體培養(yǎng)基：酵母提取物 5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，胰蛋白胨 10 g·L-1。

生化變種鑒定基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨 1.0 g·L-1，磷酸二氫胺 1.0 g·L-1，氯化鉀 0.2 g·L-1，七水硫酸鎂0.2 g·L-1，溴百里酚藍指示劑 3.0 ml·L-1，pH 調(diào)至 7.0。

2，3，5 -三苯基氯化四氮唑(TTC)培養(yǎng)基：水解干酪素 1 g·L-1，蛋白胨 10 g·L-1，甘油 5 mL·L-1，瓊脂粉 32 g·L-1，使用前，每 1 L 培養(yǎng)基加 5 mL 質(zhì)量濃度為 10 g·L-1的 TTC 溶液。

牛肉膏蛋白胨(NA)液體培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g·L-1，葡萄糖 10 g·L-1，蛋白胨 5 g·L-1，酵母粉 0.5 g·L-1，pH調(diào)至7.0。

供試噬菌體：編號分別為P1556-1、P1556-2、P7-1、P574、P1521、P1555-L、P1555-1 和 P1555-M，分離自江西、廣東等地作物青枯病土壤，由華南農(nóng)業(yè)大學植物細菌研究室提供并保存。

1.2 青枯菌的分離純化與保存

2019—2020年，在番茄青枯病發(fā)病高峰期間，前往江西省贛南地區(qū)各市、縣區(qū)采集番茄青枯病標本，用TTC選擇性培養(yǎng)基分離青枯菌，30 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h，挑取青枯菌典型單菌落，在TTC平板上劃線純化，繼代3次，獲得純化菌株。用青枯菌特異性引物759(5′-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3′)和 760(5′-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3′)[7]進行PCR鑒定，將擴增得到280 bp特異目的片段的青枯菌菌株，-80 ℃甘油保存。同時，用細菌基因組DNA提取試劑盒，提取各菌株DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 青枯菌生化變種測定

參照Hayward等[5]、華靜月等[6]方法。分別將乳糖、甘露醇、山梨醇和甜醇加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，質(zhì)量濃度均為 10 g·L-1，分裝試管，每管 4～5 mL，110 ℃條件下滅菌20 min。纖維二糖和麥芽糖經(jīng)過濾滅菌后，分別加入滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，質(zhì)量濃度為10 g·L-1。每個菌株每種化合物接種3支試管，以不接種青枯菌為對照，28 ℃條件下培養(yǎng)21 d。

1.4 青枯菌致病性測定及數(shù)據(jù)處理

參照何自福等[16]的方法，選擇對青枯病表現(xiàn)不同抗性的5個番茄品種，分別為紅圣佳二號(抗病)、金艷 (中抗)、多寶 (中抗)、粉霸 (感病)和精棚T紅(高感)，作為致病性分化的鑒別品種。將健康番茄種子播于穴盤消毒基質(zhì)中，待4～5片葉苗齡時用于接種。采用浸根接種方法，將番茄根部浸于1×108CFU·mL-1青枯菌懸液中，15 min 后移栽到盆缽中，每盆種2株，以浸無菌水的植株為空白對照，每個菌株接種每個番茄品種20株，定期記錄發(fā)病情況，接種后第45天，各處理病情穩(wěn)定，統(tǒng)計發(fā)病率。采用離差平均和的系統(tǒng)聚類方法(即Ward聚類)對數(shù)據(jù)進行聚類分析。

1.5 egl基因擴增和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

內(nèi)源葡聚糖酶基因(egl基因)擴增引物：Endo-F(5′-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC-3′)和 Endo-R(5′-GCGTTGCCCGGCACGAACACC-3′)。PCR 擴增反應(yīng)程序：96 ℃ 預(yù)變性 9 min；95 ℃ 變性 1 min，70 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物交由睿博興科生物技術(shù)公司進行測序，將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，并與相關(guān)序列進行比對(參考序列信息見表1)。用Clustalx和MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Jukes and Cantor模型鄰接法 (Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000次重復(fù)Bootstrap統(tǒng)計學檢驗后構(gòu)建發(fā)育樹。

表1 參考序列信息Table 1 Referenced sequence information

續(xù)表1 Continued table 1

1.6 噬菌體敏感性測定

噬菌體培養(yǎng)：在15 mL的LB液體培養(yǎng)基中，將青枯菌與噬菌體按照體積比1∶1混勻，在30 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)過夜。

雙層平板制備：取青枯菌菌液100 μL加入15 mL、50 ℃的半固體培養(yǎng)基，迅速混勻倒入固體培養(yǎng)基平板上，制成雙層平板，點接 3 μL 噬菌體液，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察噬菌斑產(chǎn)生情況。根據(jù)青枯菌被侵染的噬菌體數(shù)量(n/個)判別青枯菌對噬菌體的敏感性，標準：n≤2，敏感性弱；3≤n≤5，敏感性中等；6≤n≤7，敏感性強；n≥8，敏感性特強。

2 結(jié)果與分析

2.1 青枯菌的分離純化

2019—2020年，在江西省贛南地區(qū)各市、縣番茄種植地均有青枯病發(fā)生，采集自于都、上猶、石城、瑞金等9個縣(市)的番茄青枯病病株中，共分離和鑒定出44個青枯菌株，其中于都縣9個，上猶縣7個，石城縣4個，瑞金市2個，大余縣3個，安遠縣3個，會昌縣6個，興國縣2個，全南縣8個。

2.2 青枯菌的生化變種鑒定

根據(jù)對6種碳水化合物的利用情況(表2)，44個番茄青枯菌可劃分為生化變種Ⅲ和Ⅳ，其中，來自大余縣的3個青枯菌菌株為生化變種Ⅳ，其余的41個青枯菌均為生化變種Ⅲ，表明贛南地區(qū)番茄青枯菌以生化變種Ⅲ為主。

表2 青枯菌生化變種鑒定1)Table 2 Biovar identification of Ralstonia solanacearum

2.3 青枯菌的致病力測定

青枯菌接種紅圣佳二號(抗病)、金艷(中抗)、多寶(中抗)、粉霸(感病)、精棚T紅(高感)5個抗性程度不同的番茄品種，結(jié)果表明，44個菌株在不同的番茄品種上的致病力存在明顯差異(表3)。

表3 44個青枯菌接種5個番茄品種的發(fā)病率及聚類分組Table 3 Incidence of 44 Ralstonia solanacearum strains inoculated to five tomato cultivars and their clustering results

采用系統(tǒng)聚類中的離差平均和的聚類方法(即Ward聚類)，對44個菌株接種5個番茄品種的青枯病發(fā)病率結(jié)果進行聚類分析，明確青枯菌之間的致病力差異。采用離差平均和方法，樣本間的距離采用歐氏距離，該距離數(shù)值的大小反映樣本之間的相似度，數(shù)值越小，2個樣本之間的相似度越高，數(shù)值越大，則相似度越低。本研究以歐氏距離1.2為參考標準，將44個青枯菌聚為3個組(圖1)。第Ⅰ組共有29個菌株，分別來自除大余縣外的8個縣(市)；第Ⅱ組的7個菌株分離自于都、上猶、石城、會昌4個縣，該組致病力為中等強度；第Ⅲ組的8個菌株分離自于都、上猶、石城、大余、安遠5個縣，致病力弱，其中來自上猶縣的Tm1919致病力最弱。上述結(jié)果表明，贛南地區(qū)番茄青枯菌致病力分化現(xiàn)象明顯，在于都、上猶和石城縣均存在致病力強、中、弱3種類型的菌株，但總體來看，贛南地區(qū)番茄青枯菌以致病較強的菌株占優(yōu)勢。

圖1 基于44個青枯菌接種5個番茄品種發(fā)病率的聚類分析結(jié)果Fig. 1 Clustering results based on the incidence of 44 Ralstonia solanacearum strains inoculated to five tomato cultivars

2.4 青枯菌序列變種及系統(tǒng)發(fā)育分析

44個青枯菌的egl基因片段序列與標準參考菌株進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明，江西省贛南地區(qū)的番茄青枯菌屬于亞洲分支、演化型I(PhylotypeⅠ)的8個序列變種(Sequevar)。其中Tm1929、Tm1935和Tm1937與馬鈴薯青枯菌JT523(留尼汪島)屬于 Sequevar 13；Tm1908、Tm1920、Tm1923、Tm1924、Tm1930、Tm1931、Tm1933、Tm1934、Tm1940～Tm1943、Tm2046、Tm2054共14個菌株與來自中國的番茄青枯菌PSS8 屬于 Sequevar 14；Tm1925、Tm1928、Tm1932、Tm2055和Tm2058與來自中國的番茄青枯菌PSS358 屬于 Sequevar 15；Tm1913～Tm1919、Tm2047共8個菌株與來自中國的花生青枯菌P11 屬于 Sequevar 17；Tm1901～Tm1904、Tm1907、Tm1926、Tm1938、Tm1939共8個菌株與來自法國的番茄青枯菌GMI1000均為Sequevar 18；Tm1944與來自中國臺灣的番茄青枯菌PSS219為Sequevar 34；Tm1936與來自中國的煙草青枯菌Tb28為Sequevar 44；Tm1945、Tm2048～Tm2050 共 4 個菌株與來自中國的桑青枯菌M2同為Sequevar 48。

2.5 青枯菌序列變種(Sequevar)的地理分布

在所分離的44個番茄青枯菌中，Sequevar 14共有14個菌株，分布于于都、瑞金、大余、會昌、興國、全南 6 個縣 (市)；Sequevar 18 有 8 個菌株，分布于會昌、石城、于都3個縣；Sequevar 17有8個菌株，其中7個分布于上猶縣，1個來自興國縣；Sequevar 15有5個菌株，來自于石城、大余、全南3個縣；Sequevar 48的4個菌株，全部來自全南縣；Sequevar 13有3個菌株，分布于石城和安遠縣；Sequevar 34 和 Sequevar 44 各有 1 個菌株，分別來自全南和安遠縣。上述結(jié)果表明，贛南地區(qū)番茄青枯菌序列變種存在豐富的多樣性。

2.6 青枯菌對噬菌體的敏感性測定

雙層平板法檢測8個噬菌體裂解青枯菌的試驗結(jié)果(表4)表明，44個番茄青枯菌中，只有菌株Tm2047對噬菌體的敏感性弱，有12個菌株對噬菌體的敏感性表現(xiàn)為中等，有4個菌株對噬菌體的敏感性較強，另有27個菌株都能被8個噬菌體裂解，其敏感性表現(xiàn)為特強。上述結(jié)果表明，贛南地區(qū)番茄青枯菌對噬菌體普遍表現(xiàn)敏感。

3 討論與結(jié)論

不同地理來源的青枯菌在與寄主長期協(xié)同進化的過程中，演化出明顯的生理分化型或菌系多樣性。國外報道，番茄青枯菌屬于1號生理小種，分為演化型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[17-18]，生化變種Ⅰ、II、III和IV[19-20]，存在 Sequevar 1、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、18、20、29、31、35、41、38、39、46、52 等 22 個序列變種[21-23]。在我國，已報道的番茄青枯菌屬于1號生理小種、演化型Ⅰ，分為生化變種II、III和IV，存在 Sequevar13、14、15、16、17、18、34、44、48和54等10個序列變種[24-25]。曾憲銘等[26]曾測定廣東省13種農(nóng)作物上的129個青枯菌，其生化變種鑒定為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及其亞型，其中番茄青枯菌為生化變種Ⅲ和Ⅳ，鄭向華等[27]也獲得類似的研究結(jié)果，將番茄青枯菌鑒定為生化變種Ⅲ。2009年，Xu等[28]基于演化型分類框架，對來自我國13個省、17種不同寄主植物上的286株青枯菌進行多樣性分析，明確了我國青枯病菌具有豐富的遺傳多樣性，其中番茄青枯菌屬于演化型Ⅰ，并有Sequevar 13、14、15、16、17、18、44等 7個序列變種。2011年，Xue等[24]分析了我國15個省、14種寄主植物上的319株青枯菌，基于PCR指紋圖譜及演化型框架，將其中的番茄青枯菌鑒定為演化型Ⅰ，存在 Sequevar 13、14、15、17、18、34、44、48 等 8 個序列變種。

本研究對江西省贛南地區(qū)的番茄青枯菌進行了分離和菌系分析，結(jié)果顯示，在分離鑒定出的44個青枯菌中，有41個菌株為生化變種Ⅲ(占93.2%)，另有3個菌株屬于生化變種IV，不存在生化變種I和II，與國內(nèi)報道的番茄青枯菌生化變種結(jié)果基本相似。盡管我國的番茄青枯菌均屬于1號生理小種，但菌株之間致病力存在差異。本研究通過接種試驗，根據(jù)在5個不同青枯病抗性的番茄品種上的發(fā)病情況，將來自贛南地區(qū)的番茄青枯菌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共3個致病類型，而且致病力較強的菌株占65.91%，15.91%的菌株致病力中等，18.18%的菌株致病力較弱，可見，贛南地區(qū)番茄青枯菌的致病力存在明顯差異，而且致病力較強的菌株是本地區(qū)的優(yōu)勢菌群，這將為贛南地區(qū)的番茄抗青枯病育種工作提供指導(dǎo)。演化型和egl基因序列分析結(jié)果表明，44個番茄青枯菌株均屬于演化型I，符合亞洲起源的演化型Ⅰ分類框架[7]，進一步研究顯示，贛南地區(qū)番茄青枯菌存在8個序列變種，分別為 Sequevar 13、14、15、17、18、34、44 和 48，未發(fā)現(xiàn) Sequevar 16，其中 Sequevar 14(占 31.8%)在本地區(qū)的番茄主要種植地區(qū)均有分布，表明贛南地區(qū)番茄青枯菌存在豐富的遺傳多樣性。

噬菌體是侵染細菌的病毒，具有高度的特異性及快速裂解宿主(寄主)的能力，可用于植物細菌病害的防治[29-31]。有研究表明，通過使用噬菌體組合的方法，能夠顯著降低青枯菌數(shù)量，對番茄青枯病具有較好的防治效果[32]。而測定青枯菌對噬菌體的敏感性，可為利用噬菌體防治植物青枯病提供參考。本研究結(jié)果表明，在44個青枯菌中，有61.36%的青枯菌對供試的8個噬菌體敏感，即都能被8個噬菌體裂解，表明贛南地區(qū)番茄青枯菌對噬菌體普遍表現(xiàn)敏感。然而，仍有12個菌株對8個噬菌體的綜合敏感性表現(xiàn)為中等，而Tm2047菌株對噬菌體不敏感。由此可見，生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)本地區(qū)青枯菌菌系的多樣性及對噬菌體的敏感性，有選擇性地進行噬菌體組合，以減輕番茄青枯病的發(fā)生危害。