張滌娟，阮 健，胡衛(wèi)華

（皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，安徽 蕪湖 241000）

目前，不孕不育問題影響著8%～15%的育齡期夫婦。越來越多的不孕癥患者選擇實施體外受精-胚胎移植。男方的年齡及精子的總數、活動能力、形態(tài)及DNA的完整性可影響不孕癥患者實施體外受精-胚胎移植的效果。在對不孕癥患者進行體外受精-胚胎移植的過程中，密度梯度離心法和上游法是兩種處理精液的常用方法。精子的質量可影響胚胎的質量和胚胎的結局。在使用密度梯度離心法處理精液時，可以通過不連續(xù)的密度梯度從死精子、白細胞和精漿等復雜成分中分離出高質量的精子。同時，健康的精子會暴露在離心的應激環(huán)境中，可能會導致精子的DNA受損。與密度梯度離心法相比，上游法是更為適合的處理精液的方法[1]。近年來，隨著輔助生殖技術的不斷進步，精液處理方法也在不斷更新，每種精液處理方法各有優(yōu)缺點。如果能綜合這些處理方法的優(yōu)點，準確地篩選出優(yōu)勢精子，有利于后續(xù)精子與卵子相結合，進而可培養(yǎng)出更多的優(yōu)質胚胎。近年來，我中心應用先密度梯度離心后上游法常規(guī)處理精液，明顯改善了胚胎結局。本次研究主要比較用密度梯度離心法、上游法、先密度梯度離心后上游法處理精液對體外受精-胚胎移植后胚胎結局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對象是2017年1月至2019年9月期間在我院生殖中心實施體外受精-胚胎移植的172例不孕癥患者。在這些患者中，采用密度梯度離心法處理男方精液的患者有33例（A組），采用上游法處理男方精液的患者有74例（B組），采用先密度梯度離心后上游法處理男方精液的患者有65例（C組）。本次研究對象的納入標準是：1）年齡＜35歲；2）體內基礎性激素的水平處于正常范圍內；3）發(fā)生不孕癥的原因為存在輸卵管因素；4）配偶進行精液常規(guī)檢查的結果基本正常。三組患者的年齡、不孕年限、體質量指數（BMI）、基礎性激素水平、獲卵數、MⅡ卵子數等一般資料相比，P＞0.05，具有可比性。詳見表1。

表1 三組患者一般資料的比較（± s ）

表1 三組患者一般資料的比較（± s ）

組別 年齡（歲） 不孕年限（年）BMI 血清促卵泡生成激素（ FSH）（mIU/mL）血清黃體生成素（LH）（mIU/mL）血清雌二醇（ E2）（pg/mL） 獲卵數（個） M Ⅱ卵數（個）A組（n=33）28.70±3.386 3.58±2.702 22.21±3.246 4.60±2.255 2.90±1.806 42.19±21.046 15.64±8.362 13.30±7.269 B組（n=74）29.54±3.062 3.29±2.755 22.42±2.740 4.73±2.754 3.27±3.222 45.41±35.672 17.51±10.340 14.60±8.698 C組（n=65）28.66±2.922 3.52±1.483 21.77±1.982 4.34±2.532 2.34±2.289 48.61±19.625 17.86±9.729 14.92±8.184 t值 1.678 2.882 1.139 0.366 2.089 0.607 0.604 0.438 P值 0.190 0.059 0.323 0.694 0.127 0.546 0.548 0.646

1.2 研究方法

1.2.1 精液標本收集方法 男方禁欲2～7 d。在女方取卵的當日，男方手淫取精。用塑料取精杯收集精液。將裝有精液樣本的塑料取精杯放到36℃的培養(yǎng)箱內進行液化處理。

1.2.2 精子制備方法 1）用密度梯度離心法處理A組患者配偶的精液樣本，方法是：在尖底離心管的下層加入2.0 mL濃度為80%的密度梯度分離液，在尖底離心管的上層加入2.0 mL濃度為40%的密度梯度分離液。將液化的2 mL精液樣本緩慢地加入到梯度液的上方，離心處理20 min，離心機的轉速為1500 r/min。棄去精液和兩層密度梯度分離液。吸出沉淀物后，加入2 mL的洗精液，離心處理8 min后，棄去上清液。重復洗精1次，留取沉淀物，加入0.5 mL的受精液。檢測離心后精子的活力和密度，放到室溫的環(huán)境下備用。2）用上游法處理B組患者配偶的精液樣本，方法是：按照1:1的比例加入液化的精液和Quinn's1020培養(yǎng)基。離心管傾斜45°，用上游法處理30 min。轉移上層液體，離心處理8 min，棄去上清液。加入0.5 mL的受精液，混勻，記錄上游處理后精子的活力和密度，放到室溫的環(huán)境下備用。3）采用先密度梯度離心后上游法處理C組患者配偶的精液樣本，方法是：采用密度梯度離心法對精液進行處理后，洗滌精液，棄去上清液。在沉淀物中加入1 mL的受精液。采用上游法處理約15 min，吸取上清液，調精，以備用。

1.2.3 授精及去顆粒細胞方法 采用集中受精法處理精液。卵子體外培養(yǎng)2～6 h后，按精卵比例為10000～20000:1受精。在加精4～6 h后去顆粒細胞，在鏡下可以清楚地觀察到卵子的情況。若透明帶間隙內有兩個極體，表示MⅡ卵成功受精。若透明帶間隙內有一個極體，表示卵子為成熟的MⅡ卵，但未成功受精。若透明帶間隙內無極體，表示卵子為未成熟的卵子。將受精卵轉移至卵裂培養(yǎng)皿中。去顆粒細胞后，若受精率＜30%，患者簽署《知情同意書》后，進行早期補救卵胞質內單精子注射治療。

1.2.4 胚胎培養(yǎng)和囊胚培養(yǎng)的方法 使用Peter胚胎評分標準對胚胎的形態(tài)進行分級，使用Gardner評分標準對囊胚進行評級。

1.3 觀察指標

統計三組患者卵子的正常受精率、正常卵裂率、優(yōu)質胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率、MⅡ卵受精率、卵子補救率和胚胎滯育率。卵子的正常受精率=D1出現2PN卵子數/加精卵子的總數×100%。正常卵裂率=卵裂胚胎數/受精卵總數×100%。優(yōu)質胚胎率=優(yōu)質胚胎數/正常受精卵裂胚胎數×100%?？衫门咛ヂ?可利用胚胎數/卵裂胚胎數×100%。囊胚形成率=(D5＋D6）囊胚總數/行囊胚培養(yǎng)的卵裂期胚胎總數×100%。MⅡ卵受精率=受精卵子的總數/MⅡ卵子的總數×100%。卵子補救率=補救周期數/總周期數×100%。胚胎滯育率=滯育胚胎數/正常受精卵裂胚胎數×100%。

1.4 統計學方法

使用SPSS19.0統計軟件分析本次研究中的所有數據。計量資料各變量經檢驗不符合正態(tài)性分布或方差齊性，差異采用非參數檢驗。計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

三組患者卵子的正常受精率、正常卵裂率、優(yōu)質胚胎率、可利用胚胎率、囊胚形成率相比，P＞0.05。C組患者的MⅡ卵受精率高于A組患者和B組患者，P＜0.05；其卵子補救率、胚胎滯育率均低于A組患者和B組患者，P＜0.05。詳見表2。

表2 三組患者胚胎結局的比較[%（個/個）]

3 討論

目前，在輔助生殖技術領域中制備精液的方法有很多。這些方法均旨在選擇高質量的精子，以確保實施體外受精-胚胎移植的質量[2]。處理精液的方法主要包括密度梯度離心法和上游法。將這兩種方法結合使用，可篩選出更多有活力的優(yōu)質精子。研究表明，機械性離心處理操作對精子的功能有很大的影響。在對精液進行離心處理的過程中，由脂質過氧化引起活性氧的形成可能會對線粒體造成損傷，從而可導致精子受損。采用密度梯度離心法處理的精子回收率較高，可去除精液中的抗精子抗體、白細胞等不利于受精的成分，可得到更多高質量的精子。采用上游法篩選出的精子活動率較高，但精子的回收率較低。此法適用于精液正常的患者。在畸形精子病例中，雖然采用密度梯度離心法和上游法都可以改善患者精子的質量，但采用密度梯度離心法可以獲得更多形態(tài)正常、DNA完整的精子。目前，沒有一項技術能夠同時滿足這些要求。聯用密度梯度離心法和上游法處理精液，既可以保證可供受精精子的數量，又可以提高可供受精精子的質量。密度梯度離心法的多次離心處理可以徹底去除精液中不利于受精的成分。上游法則可以降低精子的畸形率。聯用兩種方法得到的精子更易與卵子在體外受精成功[3]。

本次研究的結果證實，在對不孕癥患者實施體外受精-胚胎移植期間，與用密度梯度離心法、上游法處理男方精液相比，用先密度梯度離心后上游法處理男方精液，不但可以明顯提高不孕癥患者MⅡ卵的受精率，還可以增加其優(yōu)質胚胎的數量，降低其卵子補救率和胚胎滯育率。