郭利芳，吳肖淮，顏 燕，沈振國

(海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，海南?？?70216)

泥鰍是一種形體小而細長的淡水經(jīng)濟型魚類，其富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)和維生素，營養(yǎng)價值較高，在我國食用歷史悠久［1－2］。傳統(tǒng)水養(yǎng)鮮活方式進行運輸和銷售泥鰍的方式不符合現(xiàn)代社會對食品衛(wèi)生、環(huán)保及貯運物流的要求，而集中宰殺后通過冷鏈供應(yīng)必然會成為今后主要銷售模式，因此貯藏過程中品質(zhì)的保持尤為重要。冰溫貯藏通過有效地抑制細菌繁殖、延緩脂肪氧化、降低汁液流失，能較好地保持魚類的鮮度［3－5］。植物源多酚具有安全可靠、抑菌、抗氧化等活性。竇川林等［6］研究發(fā)現(xiàn)－2.5℃貯藏時，3 g/L茶多酚處理可以較好地保持聚氯乙烯保鮮膜包裝的泥鰍肌原纖維蛋白的功能特性。丁景等［7］發(fā)現(xiàn)抗氧化劑能夠顯著抑制微凍貯藏泥鰍肌原纖維蛋白的氧化而維持肌原纖維蛋白的功能，其中丁香提取物、植酸與BHT具有較好的效果。冰溫貯藏可以較好地保持肉制品的品質(zhì)，有關(guān)冰溫保鮮肉制品的報道較多，有關(guān)黑麥多酚貯藏保鮮肉制品的報道也較多［8－9］，而鮮見有關(guān)黑麥多酚處理泥鰍冰溫貯藏的報道，因而本研究對黑麥多酚處理泥鰍在冰溫貯藏條件下肌原纖維蛋白功能特性的影響進行研究，為泥鰍的生物保鮮和深加工、烹飪所用原料提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海南泥鰍:體態(tài)完好，體型均勻，平均體量50 g左右，體長(9.0±2.5)cm 購于?？诤２ㄊ袌?黑麥，鹽酸胍、磷酸鹽、溴酚藍、鹽酸(均為分析純)北京索萊寶科技有限公司;Tris－HCl、十二烷基磺酸鈉(SDS)、5，5＇－二硫代雙(2－硝基苯甲酸)(DTNB)、2，4－二硝基苯肼(DNPH)(均為分析純)美國Sigma公司。

ST2100p H計 上海梅特勒－托利多儀器有限公司;FA25高速剪切乳化分散機 上海弗魯克流體機械制造有限公司;Thermo冷凍離心機 美國Thermo有限公司;HPP－9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;FA2004電子分析天平 上海華巖儀器設(shè)備有限公司;DW－25W518型冰箱 青島海爾電器有限公司;722－P型可見分光光度計 上?，F(xiàn)科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理及貯藏實驗 黑麥多酚提取參考文獻［8－9］的方法進行，粗提物中每克多酚含量為52.1 mg沒食子酸當(dāng)量。泥鰍宰殺后去內(nèi)臟，清洗瀝水后剪成5 cm×3 cm×1 cm片狀，分成4份，3份在無菌蒸餾水配制的1.5、3.0、4.5 g/L黑麥多酚溶液中浸泡，另外1份在無菌蒸餾水中浸泡，然后各處理組放置在滅菌的硬塑托盤中，4℃靜置30 min，待表面水分晾干后，保鮮膜封口，速凍至－0.7℃并在此溫度下貯藏(前體實驗測定泥鰍的冰點溫度為－0.7℃)，在貯藏第0、5、10、15、20、25、30 d時提取肌原纖維蛋白并測定其基本理化特性指標(biāo)。

1.2.2 肌原纖維蛋白的提取 參考文獻［10－11］的方法，取一定貯藏期泥鰍凈肉樣品，加入5倍體積的20 mmol/L、p H7.5的冰冷磷酸鹽緩沖溶液，高速勻漿50 s，紗布過濾后取濾液，然后在4℃下10000 r/min離心10 min，獲得的沉淀物中加入4倍體積0.1 mol/L KCl緩沖液(pH7.0，含有20 mmol/L Tris－HCl)懸浮后高速勻漿30 s，再4℃下10000 r/min離心10 min，重復(fù)2次懸浮、勻漿、離心過程，所得沉淀即為MP，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 肌原纖維蛋白功能特性的測定

1.2.3.1 溶解性的測定 參考周茹等［12］的方法略作修改，稱取0.1 g的MP，加入40 mL 50 mmol/L Na2HPO4緩沖液(pH6.25，含有0.6 mol/L NaCl)，勻漿30 s，混合均勻后于4℃靜置1 h，然后4℃離心(5000 r/min、10 min)，上清液用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，采用下式計算溶解度。

溶解度(%)=離心后上清液中蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)/離心前溶液中蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)×100

1.2.3.2 表面疏水性的測定 參照Chin等［10］的方法并略作修改，用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.0)將MP配制成5 mg/mL的溶液，取1 mL配制好的樣液并加入200μL溴酚藍(1 mg/mL)，室溫下充分混合10 min，離心(8000 r/min，10 min)取上清液稀釋10倍，595 nm處測吸光值(A樣品)，以磷酸鹽緩沖液作為空白對照A對照。肌原纖維蛋白表面疏水性用肌原纖維蛋白結(jié)合溴酚藍的質(zhì)量來表示。按照下式計算肌原纖維蛋白表面疏水性。

1.2.3.3 羰基、巰基含量的測定 羰基含量的測定采用2，4－二硝基苯肼(DNPH)法，參照Oliver等［13］的方法并略加修改。配制25 mg/mL的MP溶液，吸取兩份配制好的溶液分別加入2，4－二硝基苯肼(DNPH)和鹽酸，以6 mol/L鹽酸胍調(diào)零，280 nm處測定加入鹽酸后樣品的吸光度，再以加入鹽酸的樣品調(diào)零，370 nm處測定加入DNPH后樣品的吸光度。羰基含量的計算按下式進行。

式中:A370:370 nm波長下的吸光度;2.2×104L·mol－1·cm－1:摩爾吸光系數(shù);106:mmol/mg到nmol/mg的單位轉(zhuǎn)換系數(shù);C:用6 mol/L鹽酸胍做空白調(diào)零后，280 nm下測得的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/mL)。

總巰基含量參照劉琴等［14－15］的方法進行測定。取配制好的5 mg/mL的MP溶液1 mL，加入9 mL Tris－甘氨酸溶液，室溫下勻漿30 s，離心除去不溶性蛋白，取上清液4 mL，加入0.4 mL 0.01 mol/L DTNB和0.05 mol/L醋酸鈉的混合溶液，在40℃下保溫30 min，412 nm處測定吸光度值，空白對照用不加蛋白溶液代替。計算公式如下:

式中:13600:巰基濃度計算使用摩爾消光系數(shù)L·mol－1·cm－1，A:樣品在412 nm處測得的吸光度值，C:樣品的蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

1.2.3.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定 MP的乳化性和乳化穩(wěn)定性參考文獻［16－17］的方法采用濁度法進行測定。將MP用0.1 mol/L的磷酸緩沖液(4℃，pH6.5)配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋白溶液，取配制好的蛋白溶液20 mL，加入5 mL大豆油，10000 r/min勻漿1 min，立即從距管底5 mm處吸取50μL乳濁液，然后加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液，振蕩均勻，靜置0、10 min后于500 nm處測其吸光值。分別記為A0、A10，空白用0.1%SDS溶液代替。

乳化活性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)計算分別用下式計算:

式中:A0、A10為乳濁液在0、10 min時吸光度值;φ為油相體積分?jǐn)?shù)，%;ρ表示蛋白質(zhì)量濃度，g/mL;稀釋倍數(shù)為101。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個處理重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 10.0中的ANOVA進行顯著性分析，P＜0.05表示兩樣本具有顯著差異。采用SigmaPlot 14.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對泥鰍貯藏過程中MP溶解性的影響

不同處理泥鰍貯藏過程中MP溶解性如圖1所示，從中可以看出所有處理組MP的溶解性都隨著貯藏時間的延長而不斷下降，其中對照組由貯藏0 d時的65.6%下降到貯藏30 d時的20.6%，而經(jīng)過黑麥多酚處理后樣品下降的程度都低于對照，15、30、45 g/L處理組分別由67.2%、65.9%和68.3%下降到25.6%、27.4%和28.1%，在貯藏20 d后各處理組MP的溶解性都顯著高于對照(P＜0.05)，4.5 g/L處理組的效果更好，與文獻報道的3 g/L茶多酚抑制了泥鰍肌原纖維蛋白的氧化變性，從而使其具有較好的溶解性，BHT與植酸處理后泥鰍肌原纖維蛋白的溶解性好于丁香、油菜粉以及VE處理的結(jié)果類似［6－7］。貯藏過程中泥鰍MP的溶解性下降主要是由于蛋白質(zhì)被氧化結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水基團外露，導(dǎo)致蛋白空間構(gòu)象發(fā)生變化，從而形成不溶性的蛋白質(zhì)聚集體，導(dǎo)致原有蛋白質(zhì)與結(jié)合水的狀態(tài)被破壞，這是肌原纖維蛋白溶解性不斷下降的重要原因［18］。另外隨著貯藏時間的延長，羰基含量的增加和巰基含量的下降，導(dǎo)致二硫鍵形成，進一步促進了蛋白質(zhì)溶解性的下降［19］。黑麥多酚具有較強的抗氧化活性，一定程度上抑制了蛋白質(zhì)的氧化，從而保證了泥鰍MP的溶解性，為保持泥鰍MP乳化性、凝膠性等其他功能特性提供了保障。

圖1 黑麥多酚處理對泥鰍肌原纖維蛋白溶解性的影響Fig.1 Effects of rye polyphenols on the solubility of loach MP during storage

2.2 不同處理對泥鰍貯藏過程中MP表面疏水性的影響

不同處理泥鰍貯藏過程中MP表面疏水性變化如圖2所示，從中可以看出各處理組MP的表面疏水性都隨著貯藏時間的延長而不斷增加，對照組和各處理組泥鰍肌原纖維蛋白與溴酚藍結(jié)合量貯藏0 d時分別為13.71、12.82、13.21和12.74μg，而30 d時分別達到了51.13、45.14、43.72和41.21μg。在整個貯藏過程中，黑麥多酚處理組泥鰍MP與溴酚藍結(jié)合量均顯著低于對照組(P＜0.05)，且黑麥多酚濃度越大，泥鰍MP與溴酚藍的結(jié)合量越小，表明黑麥多酚處理組泥鰍MP表面疏水性較低。在貯藏15 d后，4.5 g/L處理組泥鰍MP與溴酚藍的結(jié)合量低于其它兩個處理組(P＞0.05)。泥鰍MP表面疏水性隨微凍時間的延長而增大主要是由于貯藏過程中蛋白質(zhì)被氧化變性導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，表面疏水性基團暴露，表面疏水性增加，此外，MP中巰基的氧化反應(yīng)也可導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性的增加。而黑麥多酚處理組泥鰍MP貯藏過程中表面疏水性降低，說明黑麥多酚能一定程度上減緩蛋白質(zhì)的氧化以及變性，這一結(jié)果與報道的0.3%茶多酚能延緩－2℃冷藏下大黃魚魚片肌原纖維蛋白變性和降解程度，－80℃凍藏大黃魚肌原纖維蛋白的氧化程度低于－18℃的結(jié)果相一致［20－21］。充分說明作為天然抗氧化劑的多酚類物質(zhì)在抑制蛋白的氧化變性方面具有較好的作用。

圖2 黑麥多酚處理對泥鰍肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effects of rye polyphenols on the surface hydrophobicity of loach MP during storage

2.3 不同處理對泥鰍貯藏過程中MP羰基、巰基含量的影響

肌原纖維蛋白中的羰基和巰基含量高低常用來間接評價蛋白質(zhì)被氧化的程度，羰基含量的增加、巰基含量的下降表明蛋白質(zhì)氧化程度的增加，泥鰍肌原纖維蛋白中羰基和巰基含量可間接反映泥鰍的新鮮度，本實驗在冰溫貯藏期內(nèi)各組泥鰍感官評價都在可接受范圍，而黑麥多酚處理組效果更好。羰基的形成與肽骨架的斷裂、一些氨基酸側(cè)鏈被活性氧攻擊有關(guān)［22］。而巰基基團具有活潑、反應(yīng)活性高的特性，是肌原纖維蛋白的功能基團，在維持肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面具有重要的作用，肌原纖維蛋白變性后往往伴隨著結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使巰基暴露后部分被氧化成－S－S－，總巰基含量明顯降低［23］。而巰基對蛋白質(zhì)的乳化性以及凝膠性有重要的影響［24］。不同處理泥鰍貯藏過程中MP羰基、巰基含量變化如圖3、圖4所示，從中可以看出各處理組MP的羰基含量都隨著貯藏時間的延長不斷上升而巰基含量不斷下降，對照組在貯藏10 d時羰基含量由2.7 nmol/mg蛋白顯著增加到4.1 nmol/mg蛋白(P＜0.05)，而貯藏15 d時巰基含量由9.7 mmol/105mg蛋白顯著下降到7.1 mmol/105mg蛋白(P＜0.05)，這與冰溫貯藏過程中泥鰍MP的氧化以及空間結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)。貯藏第15～30 d，各黑麥多酚處理組羰基含量都低于對照組而巰基含量高于對照組，其中4.5 g/L處理組效果較好(P＜0.05)，貯藏第15和30 d時巰基含量分別為7.7、5.5 mmol/105mg蛋白，而羰基含量分別為4.3、6.2 nmol/mg蛋白，說明黑麥多酚一定程度上減緩了泥鰍MP的氧化和降解，抑制了羰基含量的增加和巰基含量的下降，從而保證了泥鰍MP相對完整性和較好的溶解性等功能特性，與竇川林［6］、李倩［25］、Ramirez等［26］研究的結(jié)果相似。

圖3 黑麥多酚處理對泥鰍肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.3 Effects of rye polyphenols on the carbonyl content of loach MPduring storage

圖4 黑麥多酚處理對泥鰍肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig.4 Effects of rye polyphenols on the sulfhydryl content of loach MP during storage

2.4 不同處理對泥鰍貯藏過程中MP乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)的乳化能力是衡量蛋白質(zhì)溶液乳化脂肪的能力，表現(xiàn)為其能與水和脂肪的結(jié)合程度［27］。有研究表明蛋白質(zhì)乳化能力與其溶解度呈正相關(guān)，溶解度越高，乳化能力越好［28］。不同處理泥鰍貯藏過程中MP乳化活性和乳化穩(wěn)定性的變化如圖5、圖6所示，從中可以看出各處理組MP的乳化活性和乳化穩(wěn)定性都隨著貯藏時間的延長而不斷降低，但各處理組的EAI和ESI值都高于對照組。在0～10 d貯藏期間，各處理組與對照組EAI值差異不顯著(P＞0.05)，15 d時各處理組EAI值分別為27.32%、26.85%和27.16%，顯著高于對照組25.24%(P＜0.05)。在貯藏5～25 d過程中，3.0、4.5 g/L黑麥多酚處理組的ESI值顯著高于對照(P＜0.05)。各處理組泥鰍MP在冰溫貯藏過程中乳化能力的下降可能與蛋白質(zhì)氧化和變性致使原有的蛋白空間結(jié)構(gòu)被破壞，肌球蛋白的交聯(lián)程度增加，使蛋白質(zhì)不能形成穩(wěn)定的界面膜而喪失了表面吸附脂肪顆粒的活性有關(guān)。同時隨著貯藏時間的延長蛋白質(zhì)溶解性的降低也會導(dǎo)致其乳化活性下降［29］。本試驗結(jié)果表明經(jīng)過黑麥多酚處理后的泥鰍在冰溫貯藏過程中MP的乳化能力的下降明顯較對照組低，這與黑麥多酚抑制泥鰍MP的氧化變性、延緩肌原纖維蛋白溶解性的降低有關(guān)，與圖1的結(jié)果相呼應(yīng)。與李艷青［30］報道的添加WPI水解物可抑制鯉魚肌原纖維蛋白的氧化，從而保持其較好的乳化活性的結(jié)果相一致。茶多酚、WPI水解物、黑麥多酚等天然抗氧化劑在抑制蛋白氧化變性、維持蛋白結(jié)構(gòu)完整，從而保持蛋白溶解性、乳化性、凝膠性等基本的功能特性方面具有較好的作用，相比化學(xué)合成抗氧化劑安全性更好。

圖5 黑麥多酚處理對泥鰍肌原纖維蛋白乳化活性的影響Fig.5 Effects of rye polyphenols on the emulsifying activity of loach MPduring storage

圖6 黑麥多酚處理對泥鰍肌原纖維蛋白乳化穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of rye polyphenols on the emulsifying stability of loach MP during storage

3 結(jié)論

在冰溫貯藏過程中各處理和對照組泥鰍MP的總巰基含量不斷下降而羰基含量不斷上升，同時溶解性、乳化性降低而表面疏水性增加，黑麥多酚對冰溫貯藏過程中泥鰍肌原纖維蛋白功能性質(zhì)有明顯影響，抑制了羰基的生成、保護了巰基，降低了MP的表面疏水性，提高了其溶解度，且質(zhì)量濃度越大效果越明顯，4.5 g/L處理效果較佳。泥鰍產(chǎn)品進行黑麥多酚處理能夠有效抑制冰溫貯藏過程中蛋白質(zhì)的氧化以及功能性質(zhì)的弱化，作為天然抗氧化劑可以用于泥鰍的貯藏保鮮。