趙 銀，王羽桐，李 娟，杜文斌，譚 佳，謝建春

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京工商大學(xué)輕工技術(shù)學(xué)院，北京 100048）

少花桂（Cinnamomum pauciflorumNees）系樟科樟屬小喬木，主要分布在四川、云南、湖南、湖北、貴州、廣西等省區(qū)，通常生長于海拔400～1800（2200）m的石灰?guī)r或砂巖上的山地或山谷疏林或密林中[1]，又稱香桂、巖桂、土桂皮、香葉子樹、三條筋、臭樟等[2]。少花桂樹皮及根入藥，具有開胃健脾及散熱功能。同時，少花桂枝葉因富含芳香油，在香料工業(yè)上具有較大的應(yīng)用價值。目前少花桂的研究多集中于先通過水蒸氣蒸餾法[1-4]、同時蒸餾萃取法[5]、超臨界CO2萃取法[5]提取少花桂得到精油，再經(jīng)氣相色譜或氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography and Mass Spectrometry，GC-MS）進行分析[1-12]。所采用的樣品前處理方法需要較大的樣品量、耗時長，甚至熱敏感性成分被破壞（水蒸氣蒸餾法、同時蒸餾萃取法）。同時，氣相色譜或氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析到的僅為少花桂的揮發(fā)性組成而不是香氣組成，因為在眾多揮發(fā)性成分中，往往具有氣味活性的成分才真正對總體香氣有貢獻[13]。

氣相色譜-嗅聞聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography-Olfactometry，GC-O）[14-15]是一種利用人鼻嗅聞經(jīng)氣相色譜分離后的組分，以檢測樣品中香氣活性成分的方法，對篩選食品中的香氣活性成分及確定其對總體香氣貢獻大小非常有效。在GC-O 測量技術(shù)中，直接強度法直接確定各化合物的氣味強度，操作簡單，強度越大對總體香氣的貢獻越大[16-17]。直接強度法在酒類[18]、飲料[19]、食用油類[20]和肉制品[13,21]等多種食品香氣活性成分分析中得到應(yīng)用。頂空固相微萃?。℉eadspace Solid-Phase Micro Extraction，HS-SPME)與傳統(tǒng)預(yù)處理方法比較[22-23]，具有操作簡單、條件溫和、進樣快、分析迅速且不用任何萃取溶劑等優(yōu)點，是目前食品風(fēng)味分析的重要樣品前處理方法。

本文采用HS-SPME 處理少花桂葉，然后采用GC-MS 分析少花桂葉揮發(fā)性成分，并在此基礎(chǔ)上，采用直接強度GC-O 對少花桂葉的香氣活性成分進行研究。研究結(jié)果對于以少花桂葉為原料進行香料研制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

少花桂葉 淘寶（采自6 月，自然風(fēng)干）；C6～C25正構(gòu)烷烴（色譜純）、二氯甲烷溶劑（分析純）國藥集團北京化學(xué)試劑有限公司。

手動固相微萃取手柄（1 cm 長 75 μm CAR/PDMS）萃取纖維、7890A/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent 公司；DATU 2000 嗅聞器 美國DATUInc.公司；DF-101S 型恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋 河南予華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取 萃取纖維按使用說明先進行老化。老化程序：加熱溫度250 ℃；分流比50:1；柱溫40 ℃；老化10 min。

將風(fēng)干的少花桂葉粉碎，取0.5 g 置于15 mL 密封樣品瓶中，放入50 ℃恒溫水浴中頂空吸附35 min，磁子攪拌轉(zhuǎn)速20 r/min，待GC-MS 或GC-O 分析。

1.2.2 GC-MS 分析 色譜條件1：色譜柱DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持2 min，以3 ℃/min 升至80 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 升至230 ℃，保持2 min；載氣（He）流速3 mL/min，進樣口250 ℃；不分流模式；萃取纖維解吸5 min。

色譜條件2：色譜柱DB-5（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始柱溫40 ℃，以12 ℃/min升至100 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升至150 ℃，保持3 min，以30 ℃/min 升至250 ℃，保持2 min；載氣（He）流速3 mL/min，進樣口250 ℃；不分流模式；萃取纖維解吸5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍33～400 amu，全掃描模式；輔助加熱線溫度280 ℃。

1.2.3 GC-O 分析 GC-O 系統(tǒng)由配有FID 檢測器的Agilent 7890A GC 裝置和嗅聞裝置組成。色譜柱DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫程序同GCMS 分析。進樣口溫度250 ℃，載氣為氮氣，流速為1.0 mL/min。萃取纖維解吸5 min。每個樣品嗅聞兩次，嗅聞時評價員需要記錄氣味特征、氣味強度及保留時間。氣味強度記為1、2、3、4 四個等級[16]，“1”表示氣味較弱，“2”表示氣味強度中等，“3”表示氣味較強，“4”表示氣味非常強。

在相同條件下進樣，分析C6～C25正構(gòu)烷烴，計算保留指數(shù)（RI 值）：

式中，tn和t(n+1)分別為碳數(shù)為n、n+1 正構(gòu)烷烴的保留時間，min；ti是在tn和t(n+1)之間的第i 個化合物的保留時間，min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GC-MS 分析采用檢索NIST 11 譜庫、核對保留指數(shù)（RI）鑒定化合物，各成分的含量通過峰面積歸一化法得到。表格繪制及數(shù)據(jù)處理均采用Microsoft excel 2010 軟件，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=2）。GC-O 分析，根據(jù)保留指數(shù)（RI）、GC-MS 分析鑒定結(jié)果、嗅聞氣味特征，鑒定氣味活性化合物。

2 結(jié)果與分析

采用頂空固相微萃取制備樣品，用兩根色譜柱（極性柱DB-WAX、弱極性柱DB-5）GC-MS 分析，總離子流圖見圖1。

圖1 采用 DB-WAX 和DB-5 兩色譜柱固相微萃取/氣-質(zhì)聯(lián)機分析少花桂葉的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms for analysis of leaves of Cinnamomum pauciflorum Nees by solid-phase micro extraction(SPME) combined with gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS) on DB-WAX and DB-5 columns.

為了確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，實驗中采用雙柱（極性柱、弱極性柱）定性，根據(jù)計算機檢索質(zhì)譜庫（NIST11）、核對保留指數(shù)及嗅聞氣味特征定性，各成分的含量使用軟件按峰面積歸一化法計算而得，結(jié)果見表1。

2.1 GC-MS 分析

由表1 可知，從少花桂葉中共鑒定出88 種化合物，其中采用極性柱（DB-WAX）鑒定出74 種物質(zhì)，采用弱極性柱（DB-5）鑒定出57 種物質(zhì)。少花桂葉的揮發(fā)性成分主要由萜類化合物組成，其中單萜類27 種，倍半萜類40 種，還包括其它化合物21 種。

表1 少花桂葉頂空固相微萃取/GC-MS 及GC-O 分析結(jié)果Table 1 Experimental results of analysis of Cinnamomum pauciflorum Nees by headspace solid-phase microextraction/ GC-MS and GC-O

續(xù)表 1

從極性柱中鑒定出單萜類24 種，含量占32.57%（用面積歸一化法計算，下同）；倍半萜類34 種，含量占32.44%。單萜類中，單萜烴類12 種，其中含量最高的為D-檸檬烯（0.88%），其次為α-水芹烯（0.73%）、α-蒎烯（0.69%）和δ-4-蒈烯（0.59%）；含氧單萜類12 種，含量最高的為芳樟醇（20.05%），其次為乙酸龍腦酯（2.13%）、1,8-桉葉油素（1.52%）和（Z）-氧化芳樟醇（1.04%）。倍半萜類中，含量最高的為β-石竹烯（5.61%），其次為δ-杜松烯（4.96%）、檀香萜（4.65%）、α-古巴烯（3.98%）、β-檀香萜（2.60%）、α-香檸檬烯（2.37%）和β-芹子烯（1.01%）。從極性柱中還鑒定出其它化合物16 種，含量占19.72%，其中含量最高的為香豆素（5.82%），其次為苯乙烯（3.21%）、水楊醛（2.78%）、鄰傘花烴（2.76%）、反式肉桂醛（2.42%）和丁香酚（1.09%）。

從弱極性柱中鑒定出57 種化合物，單萜類19 種，含量占15.16%；倍半萜類25 種，含量占3.34%。單萜類中，單萜烴類9 種，其中含量最高的為α-水芹烯（0.07%），其次為α-蒎烯（0.06%）、β-蒎烯（0.05%）和月桂烯（0.05%）；含氧單萜類10 種，含量最高的為芳樟醇（14.09%），其次為α-松油醇（0.25%）、乙酸龍腦酯（0.22%）和1,8-桉葉油素（0.13%）。倍半萜類中，含量最高的為檀香萜（1.42%），其次為δ-杜松烯（0.54%）、α-古巴烯（0.37%）、β-檀香萜（0.31%）和α-律草烯（0.12%）。從弱極性柱中還鑒定出其它化合物13 種，含量占2.05%，其中含量最高的為香豆素（1.42%），其次為反式肉桂醛（0.22%）、苯乙烯（0.12%）、水楊醛（0.08%）和丁香酚（0.08%）。

以上用極性柱和弱極性柱分析少花桂葉揮發(fā)性成分的結(jié)果基本一致，在少花桂葉揮發(fā)性成分中，兩種柱檢測含量最高的均為芳樟醇，其次為香豆素、δ-杜松烯、檀香萜、α-古巴烯、苯乙烯、β-檀香萜、反式肉桂醛、乙酸龍腦酯和1,8-桉葉油素。

由于少花桂葉中揮發(fā)性成分較復(fù)雜，同一種植物因生長地區(qū)與環(huán)境的不同，所含成分及含量會有差別，且分析方法不同也會對分析結(jié)果有顯著影響。程必強等[2]采用水蒸氣蒸餾萃取不同產(chǎn)地（四川筠連、湖北鄂西利川、西雙版納勐侖）少花桂鮮葉精油，用GC-MS 分析，其中，四川筠連少花桂葉精油中共檢出22 種化合物，主要成分為黃樟油素（69.70%）、芳樟醇（14.35%）、丁香酚（4.20%）、α-莰烯（1.28%）等；湖北鄂西利川少花桂葉精油中共檢出60 種化合物，主要成分為α-蒎烯（9.09%）、檸檬醛（8.70%）、香葉醇（6.03%）、乙酸香葉酯（4.94%）、黃樟油素（4.43%）、芳樟醇（4.19%）等；西雙版納勐侖少花桂葉精油中共檢出11 種化合物，主要成分為黃樟油素（99.26%）。錢正強等[3]采用水蒸氣蒸餾萃取采自云南省威信縣3 個不同葉齡（當(dāng)年生葉、1 年生葉和2 年以上生葉）的少花桂鮮葉精油，用GC-MS 分析，檢測和鑒定出26 個揮發(fā)性組分，其中最主要的揮發(fā)性組分為黃樟油素（3 個不同葉齡含量均＞ 95%），其次為芳樟醇、1,8-桉葉油素、樟腦等。先靜緘等[5]利用超臨界CO2萃取貴州省晴隆縣少花桂鮮葉葉油并經(jīng)GCMS 分析，共檢測和鑒定出16 種組分，主要化學(xué)成分為黃樟油素（89.44%）、6-甲氧基丁香酚（4.42%）、丁香酚（1.15%）、芳樟醇（0.71%）等。

本實驗從少花桂葉中共鑒定出88 種揮發(fā)性組分，雙柱（極性柱、弱極性柱）定量結(jié)果中含量最高的均為芳樟醇（＞14%）。本實驗鑒定出較多未報道的揮發(fā)性成分，其中，以倍半萜類占最多，如順式-β-金合歡烯、環(huán)苜蓿烯、α-古蕓烯、β-波旁烯、β-檀香萜、A-二去氫菖蒲烯、桉油烯醇等。本文所得結(jié)果與以往研究的不同，可能是由于本文采用頂空固相微萃取處理風(fēng)干的少花桂葉，然后直接進行GC-MS 分析，而報道的文獻多是先提取少花桂鮮葉得到精油，再經(jīng)氣相色譜或GC-MS 進行分析，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性組分減少及其含量發(fā)生變化。

與少花桂同種同屬（樟科樟屬）的其他植物不同，本研究中少花桂葉的主要揮發(fā)性成分是芳樟醇，而Farias 等[24]研究S?o Luís 和Santa Inês 兩種錫蘭肉桂（Cinnamomum verumJ.Presl）葉精油的組成，前者主要成分為丁香酚（93.6%），后者的主要成分為苯甲酸芐酯（95.3%）。Dong[25]與賈春曉[26]等報道肉桂（Cinnamomum cassiaPresl）中主要揮發(fā)性成分是反式肉桂醛。李海泉等[27]采用超臨界CO2萃取陰香（Cinnamomum burmanni）葉揮發(fā)油，GC-MS 分析鑒定出33 種化合物，主要成分為龍腦（47.23%）和香豆素（13.20%）。王藝蓓等[28]采用無溶劑微波輔助萃取法和傳統(tǒng)水蒸餾法萃取油樟葉（Cinnamomum longipaniculatum（Gamble）N.Chao）精油，GCMS 分析主要成分均為1,8-桉葉油素。

2.2 GC-O 分析

GC-O 檢測結(jié)果中，嗅聞到的氣味主要有辛香、肉桂香、柑橘香、麝香、木香和水果香等。香氣活性成分主要為萜類化合物。單萜類8 種，包括α-水芹烯、γ-萜品烯、1,8-桉葉油素、（Z）-氧化芳樟醇、芳樟醇、4-萜品醇、橙花醇和乙酸龍腦酯，其中氣味強度最大的化合物為芳樟醇（氣味強度均為4），其次為4-萜品醇（氣味強度為3）、乙酸龍腦酯（氣味強度為3）和1,8-桉葉油素（氣味強度為2）。倍半萜類5 種，包括α-蓽澄茄烯、α-古巴烯、β-檀香萜、β-石竹烯和δ-杜松烯，其中β-檀香萜的氣味強度為3，α-古巴烯、β-石竹烯和δ-杜松烯的氣味強度均為2。還包括其它化合物10 種，包括苯乙烯、苯丙醛、水楊醛、胡椒酚、反式肉桂醛、丁香酚、乙酸肉桂酯、香豆素、肉桂酸乙酯和月桂酸乙酯，其中氣味強度最大的化合物為反式肉桂醛（氣味強度為4），其次為肉桂酸乙酯（氣味強度為3）、丁香酚（氣味強度為2）、乙酸肉桂酯（氣味強度為2）和月桂酸乙酯（氣味強度為2）。采用直接強度法GC-O 分析時，氣味強度越大，對總體香氣貢獻越大。在少花桂葉香氣活性成分分析中，氣味強度最大的化合物為反式肉桂醛和芳樟醇（氣味強度均為4），其次為4-萜品醇、乙酸龍腦酯、β-檀香萜和肉桂酸乙酯（氣味強度均為3）。

本研究中對少花桂香氣貢獻大的為反式肉桂醛和芳樟醇，Bongiovanni1 等[29]采用水蒸氣蒸餾法萃取肉桂的皮、葉和嫩枝精油，經(jīng)芳香提取物稀釋（aroma extract dilution analysis，AEDA）GC-O 檢測到26 種香氣活性成分，其中苯丙醛、反式肉桂醛、愈創(chuàng)木酚、苯乙醇、乙酸肉桂酯、2-乙酰苯甲醛和苯乙酮具有較高FD 值（Log2FD ≥10）對香氣貢獻大，Sandner 等[30]采用索氏提取法萃取肉桂嫩芽，經(jīng)硅膠分離，用GC-MS 及GC-O 檢測，共鑒定出36 種化合物，對肉桂芽香氣貢獻大的化合物為肉桂醛、苯乙醇和肉桂醇。由此可見，肉桂醛很可能為少花桂及同種屬的其他植物中的共有香成分。

3 結(jié)論

采用HP-SPME/GC-MS 分析少花桂葉，極性和弱極性兩種柱共鑒定出88 種揮發(fā)性成分，含量高（＞1%）的成分均為芳樟醇、香豆素、δ-杜松烯、檀香萜、α-古巴烯、苯乙烯、β-檀香萜、反式肉桂醛、乙酸龍腦酯和1,8-桉葉油素等。GC-O 檢測到23 種化合物有氣味活性，從氣味強度看（氣味強度≥3），反式肉桂醛、芳樟醇、4-萜品醇、乙酸龍腦酯、β-檀香萜和肉桂酸乙酯對少花桂的總體香氣貢獻大。本試驗采用MS、保留指數(shù)、嗅聞氣味的方法對少花桂葉的香氣成分進行分析鑒定，結(jié)果更加準(zhǔn)確可信，可為少花桂開發(fā)利用提供參考。