陳 瓊，陳 朋，李俊穎，崔紹華，喬 倩

（仙樂健康科技股份有限公司，廣東汕頭 515041）

兒童由于免疫系統(tǒng)不成熟，通常會比成年人更容易受到微生物的感染和引發(fā)更嚴重的疾病[1]，據(jù)報道，呼吸道感染疾病常發(fā)于5 歲以下兒童[2-3]。因此提高兒童的免疫力，增強兒童對感染性疾病的抵抗能力，有助于兒童的健康成長。

β-葡聚糖是由葡萄糖分子構(gòu)成的多糖類化合物，是真菌、酵母、一些細菌和燕麥、大麥等谷物細胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分[4]。其中酵母β-葡聚糖是首個被發(fā)現(xiàn)具有免疫增強作用的葡聚糖[5]，被公認是一個潛在的免疫調(diào)節(jié)劑，同時對先天免疫和適應性免疫有加強作用。動物體內(nèi)不存在β-葡聚糖，因此β-葡聚糖會觸發(fā)人體的免疫響應，包括促進吞噬作用和細胞因子的產(chǎn)生，從而增強機體消除感染因子的能力[6]；同時有研究表明β-葡聚糖可以增強T 細胞刺激能力，進而促進相關(guān)細胞因子的分泌，增強適應性免疫能力[7]。鋅為兒童生長發(fā)育的必要營養(yǎng)素，對于免疫系統(tǒng)的發(fā)育及免疫功能有一定的促進作用。鋅是中樞免疫器官發(fā)育，免疫細胞及免疫因子發(fā)揮正常免疫功能的保持所必須的必要元素之一，它通過干預胸腺的成熟發(fā)育，細胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細胞凋亡和基因轉(zhuǎn)錄來參與免疫過程[8]，缺乏鋅可能會導致巨噬細胞殺害胞內(nèi)寄生物的能力以及Th 淋巴細胞和NK 細胞的活性降低，從而影響T 細胞免疫功能[9]。

目前，關(guān)于酵母β-葡聚糖和鋅二者的復合配方研究主要為體外細胞實驗或以魚為研究模型[10-12]，對于酵母β-葡聚糖或鋅免疫調(diào)節(jié)功能的研究也多用成年鼠作為研究對象[13-14]，隨著小鼠周齡數(shù)增長，其免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能會發(fā)生改變，例如出現(xiàn)結(jié)構(gòu)退化、功能減退等[15]，因此酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對成年鼠的研究結(jié)果無法客觀反映其對幼年鼠免疫功能的影響。為了解二者組合對生長發(fā)育期免疫系統(tǒng)的影響，本試驗擬用幼齡小鼠，并以環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫低下模型，在此基礎(chǔ)上以酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對其進行干預，旨在于探究酵母β-葡聚糖加鋅復合配方是否可以逆轉(zhuǎn)由環(huán)磷酰胺誘導的幼齡小鼠免疫抑制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級BALB/c 幼鼠（3 周齡）48 只，體重（13.52±2.06）g，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2013-0002，實驗動物質(zhì)量合格證號No.44007200058759 廣東省醫(yī)學實驗動物中心；酵母β-葡聚糖 湖北安琪酵母有限公司；檸檬酸鋅 鄭州瑞普生物工程有限公司；小鼠IL-2、TNF-α、IFN-γ、SIgA 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司；無菌脫纖維羊血 南京茂捷微生物科技有限公司；水楊酸緩沖液 武漢百浩天生物科技有限公司。

JJ3000 型動物電子秤 美國G&G 公司；Cellometer Mini 型自動細胞計數(shù)儀 美國Nexcelom 公司；5424型小型高速離心機 德國Eppendorf 公司；Varioskan Flash 型全波長多功能酶標儀 美國Thermo 公司；Cytomics FC500MPL 流式細胞儀 美國Beckman Coulter 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥 分組：將所有小鼠適應性喂養(yǎng)一周后隨機分成空白組、模型組及復合物組，每組各16 只，雌雄各半。復合物組劑量參考人群實驗所用劑量進行設(shè)計，給予酵母β-葡聚糖和鋅復合配方（相當于酵母β-葡聚糖：90 mg/kg/d、鋅：2.8 mg/kg/d），酵母β-葡聚糖和鋅（來源于檸檬酸鋅）用等量遞增法進行混合均勻，模型組與空白組給予等體積蒸餾水，每日灌胃1 次，實驗周期為4 周（28 d）。實驗期間，溫度恒定、通風，所有小鼠自由飲食、飲水。在給藥的第14、15 d 對模型組和復合物組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg 以造小鼠免疫抑制模型。試驗第29 d，將各組小鼠再次分為兩組（每組8 只，雌雄各半）：第Ⅰ組小鼠用于體重與免疫器官質(zhì)量測定、白細胞和淋巴細胞計數(shù)、細胞因子含量測定、脾淋巴細胞活性與NK 細胞活性測定、派氏結(jié)數(shù)目計數(shù)與SIgA 含量測定實驗、小腸形態(tài)學觀察；第Ⅱ組小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）綿羊血紅細胞（Sporeshaped Red Blood Cell,SRBC），并于4 d 后（即第33 d）用于溶血空斑試驗與血清溶血素測定。

1.2.2 小鼠體重與免疫器官質(zhì)量測定 實驗前將第I 組小鼠進行稱重并記錄，最后一次給藥24 h 后對每只小鼠稱重并記錄，進行取血，完整解剖摘取脾臟、胸腺，去除脂肪和筋膜組織后稱重，根據(jù)臟器指數(shù)計算公式計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

臟器指數(shù)計算公式：臟器指數(shù)（g/g）=臟器質(zhì)量（g）× 100/體重（g）

1.2.3 小鼠白細胞和淋巴細胞計數(shù) 取第Ⅰ組小鼠血液，用全自動血細胞分析儀檢測白細胞數(shù)和淋巴細胞數(shù)。

1.2.4 細胞因子含量測定 取第I 組小鼠全血在4 ℃7500 r/min 離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說明書方法檢測血清IL-2、TNF-α 及IFN-γ 含量。

1.2.5 溶血空斑試驗與血清溶血素測定 參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[16]中方法取第II 組小鼠脾細胞進行溶血空斑試驗，取第II 組小鼠血清進行血清溶血素半數(shù)溶血值HC50測定。

1.2.6 小鼠脾淋巴細胞活性與NK 細胞活性測定參考徐榮[17]實驗方法，無菌取第I 組小組脾臟，制備脾細胞懸液；脾淋巴細胞活性應用ConA 刺激脾淋巴細胞分化增殖，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定；NK 細胞活性采用乳酸脫氫酶（LDH）法測定。

1.2.7 小鼠派氏結(jié)數(shù)目計數(shù)與SIgA 含量測定 取第Ⅰ組小鼠全段小腸，計數(shù)小腸派氏結(jié)的個數(shù)。再取出靠近十二指腸段的空腸約5 cm，刮取腸黏膜內(nèi)容物，溶于PBS 溶液中，按試劑盒說明書方法測定SIgA含量。

1.2.8 小鼠小腸形態(tài)學觀察 取第I 組小鼠小腸空腸段置于10%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋后制作切片，進行HE 染色，光鏡下觀察并拍照，測量小腸絨毛高度、隱窩深度，并計算絨毛高度與隱窩深度的比值，計數(shù)每張切片每100 個腸黏膜柱狀上皮細胞間的杯狀細胞數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以均值±標準差表示，并應用SPSS 20.0 進行統(tǒng)計學分析，總體均值的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊性時，組間比較采用LSD 法檢驗，方差不齊時需對原始數(shù)據(jù)做函數(shù)變換使各組達到方差齊性后再用LSD 法進行組間比較，P＜0.05 表示有顯著性差異，P＜0.01 表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠體重及免疫器官系數(shù)的影響

如圖1 所示，三組間的初始體重沒有差異，最終體重也沒有差異（圖1a ）。與空白組相比（圖1b、圖1c），模型組經(jīng)過腹腔注射環(huán)磷酰胺后，脾臟系數(shù)顯著降低（P＜0.05），胸腺系數(shù)極顯著降低（P＜0.01），說明環(huán)磷酰胺成功誘導了幼年小鼠的免疫器官發(fā)育缺陷。復合物組小鼠在被給予酵母β-葡聚糖加鋅復合配方后，與模型組相比，脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)都顯著升高（P＜0.05），結(jié)果說明酵母β-葡聚糖加鋅復合配方能夠改善環(huán)磷酰胺誘導的幼齡小鼠免疫器官發(fā)育缺陷，這與汪巖等實驗結(jié)果相一致[18]。

圖1 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠體重及臟器系數(shù)的影響（Mean±SD，n=8）Fig.1 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on body weight and viscera coefficient in immature mice

2.2 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠白細胞及淋巴細胞的影響

如圖2 所示，與空白組相比，模型組小鼠白細胞數(shù)和淋巴細胞比例均下降，但二者均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與模型組相比，復合物組小鼠在被給予酵母β-葡聚糖加鋅復合配方后白細胞數(shù)極顯著性提高（P＜0.01），淋巴細胞比例顯著提高（P＜0.05）。結(jié)果表明酵母β-葡聚糖加鋅復合配方能夠有效提高由環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制幼齡小鼠白細胞數(shù)和淋巴細胞比例。

圖2 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠白細胞數(shù)及淋巴細胞比例的影響（Mean±SD，n=8）Fig.2 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on number of white blood cells and lymphocyte ratio in immature mice

2.3 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠血清細胞因子的影響

IL-2 濃度升高可激活Th2 細胞，提高機體的體液免疫應答[19]；IFN-γ則可通過活化Th1 細胞，提高機體細胞免疫效能[20]，TNF-α是由巨噬細胞被激活而產(chǎn)生的，其能提高巨噬細胞的吞噬活性[21]。如圖3 所示，與空白組相比，模型組血清中IL-2、TNFα和IFN-γ含量均下降，其中TNF-α（圖3b ）、IFNγ（圖3c ）的含量極顯著降低（P＜0.01），IL-2（圖3a ）含量顯著降低（P＜0.05）。復合物組小鼠血清IL-2、TNF-α 和IFN-γ 含量有不同程度的提高，與模型組相比，IL-2 含量上升，但未見顯著性，而 TNF-α和IFN-γ含量均極顯著提高（P＜0.01）。結(jié)果表明酵母β-葡聚糖加鋅復合配方能夠改善環(huán)磷酰胺導致的幼齡小鼠細胞因子分泌減少，其中對抑制TNF-α和IFN-γ的減少尤為顯著（P＜0.01）。

圖3 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠血清IL-2、TNF-α 和IFN-γ 的影響（Mean±SD，n=8）Fig.3 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on contents of IL-2,TNF-α and IFN-γ in serum of immature mice

2.4 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠血清溶血素HC50 及溶血空斑數(shù)的影響

血清溶血素HC50和溶血空斑數(shù)是常用于衡量生物體體液免疫功能的指標[16]。如圖4 所示，與空白組相比，模型組小鼠血清溶血素HC50、溶血空斑數(shù)均極顯著降低（P＜0.01）。復合物組小鼠血清溶血素HC50及溶血空斑數(shù)與模型組相比均得到提高，且具極顯著性（P＜0.01），與空白組相比無顯著性變化（P＞0.05）。以上結(jié)果表明酵母β-葡聚糖加鋅復合配方能夠有效抑制環(huán)磷酰胺引起的免疫低下幼齡小鼠的血清溶血素水平和溶血空斑數(shù)的減少。

圖4 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠血清溶血素HC50 及溶血空斑數(shù)的影響（Mean±SD，n=8）Fig.4 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on serum hemolysin HC50 and number of hemolytic plaques in immature mice

2.5 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠脾淋巴細胞增殖能力及NK 細胞活性的影響

如圖5 所示，與空白組相比，模型組脾淋巴細胞增殖活性（圖5a ）、NK 細胞活性（圖5b ）均極顯著降低（P＜0.01）。復合物組小鼠脾淋巴細胞增殖活性、NK 細胞活性與模型組相比均得到提升，其中淋巴細胞增殖活性顯著提高（P＜0.05），NK 細胞活性極顯著提高（P＜0.01）。以上結(jié)果表明酵母β-葡聚糖加鋅復合配方能夠逆轉(zhuǎn)由環(huán)磷酰胺引起幼齡小鼠的脾淋巴細胞和NK 細胞的活性降低。

圖5 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠脾淋巴細胞增殖能力及NK 細胞活性的影響（Mean±SD，n=8）Fig.5 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on proliferation ability of splenic lymphocytes and NK cell activity in immature mice

2.6 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠小腸SIgA含量及小腸派氏結(jié)數(shù)量的影響

SIgA 是腸道黏膜免疫的功能指標，通過產(chǎn)生抗體與抗原特異性結(jié)合，抑制病原微生物的黏附功能。派式結(jié)是腸道B 細胞的生發(fā)中心，生成分泌型IgA（SIgA）[22]。如圖6 所示，與空白組相比，模型組小鼠小腸SIgA（圖6a）分泌的含量極顯著降低(P＜0.01)，派氏結(jié)數(shù)目（圖6b）顯著減少（P＜0.05），提示環(huán)磷酰胺成功誘導了腸道免疫功能障礙。與模型組相比，復合物組小鼠小腸SIgA 含量顯著提高（P＜0.05），派氏結(jié)數(shù)也極顯著增多（P＜0.01）。以上結(jié)果表明酵母β-葡聚糖加鋅復合配方能夠緩解環(huán)磷酰胺誘導的幼齡小鼠小腸SIgA 含量降低以及派氏結(jié)數(shù)量減少。

圖6 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠小腸SIgA 含量及小腸派氏結(jié)數(shù)量的影響（Mean±SD，n=8）Fig.6 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on the content of SIgA and the number of PPs in small intestine of immature mice

2.7 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠腸道黏膜形態(tài)的影響

杯狀細胞分泌腸道中黏蛋白[23]，隱窩深淺，可以側(cè)面體現(xiàn)小腸上皮細胞成熟率，分泌、吸收等腸細胞功能[24]。如圖7 所示，與空白組相比，模型組小腸絨毛高度（圖7a）、隱窩深度（圖7b）、絨毛高度/隱窩深度（圖7c）、杯狀細胞數(shù)量（圖7d）的均無顯著性差異（P＞0.05）。與模型組相比，復合物組小鼠小腸絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度比值無顯著差異，而隱窩深度顯著性降低（P＜0.05）、杯狀細胞數(shù)顯著升高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明酵母β-葡聚糖加鋅復合配方能夠顯著（P＜0.05）增加幼齡小鼠小腸杯狀細胞數(shù)量，并且有效（P＜0.05）減少小鼠小腸隱窩深度。

圖7 酵母β-葡聚糖加鋅復合配方對幼齡小鼠絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度及杯狀細胞數(shù)的影響（M±SD，n=8）Fig.7 Effects of yeast β-glucan and zinc compound formula on villus height,crypt depth,villus height/crypt depth,and the number of goblet cells in small intestine of immature mice

3 討論與結(jié)論

本研究中，模型組小鼠免疫器官指數(shù)、白細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、NK 細胞活性和免疫相關(guān)細胞因子均顯著（P＜0.05）低于空白組，表明本研究成功地用環(huán)磷酰胺誘導了幼齡小鼠的免疫抑制。然而，攝取β-葡聚糖和鋅復合配方的小鼠，經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后，免疫器官指數(shù)、外周血中白細胞和淋巴細胞比例，淋巴細胞增殖活性顯示均顯著（P＜0.05）高于模型組小鼠，提示酵母β-葡聚糖加鋅復合配方能夠逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺導致的小鼠免疫器官缺陷和免疫細胞減少。

T 細胞是一種重要的免疫細胞，分化成熟后經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)分布至外周免疫器官。其中輔助型T 細胞（Th1 和Th2）分泌的不同類型的細胞因子是決定細胞功能的重要因素，主要表現(xiàn)為Th1 細胞調(diào)節(jié)機體細胞免疫功能，Th2 細胞參與體液免疫應答。環(huán)磷酰胺可以通過使Th1/Th2 發(fā)生細胞偏倚，誘導免疫抑制[25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Th1、Th2 分泌細胞因子（IL-2、IFN-γ）在攝取酵母β-葡聚糖加鋅復合配方條件下獲得顯著（P＜0.05）上調(diào)，此結(jié)果與Bakheet 的研究結(jié)果一致[26]。在后續(xù)研究中，建議將通過細胞流式技術(shù)檢測Th1、Th2 細胞數(shù)量，確認Th1/Th2 細胞比值。

除了輔助型T 細胞以外，巨噬細胞和NK 細胞是參與殺傷腫瘤細胞的兩種主要效應細胞，巨噬細胞和NK 細胞被細胞因子和趨化因子激活，在調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移以及去除病毒中發(fā)揮核心作用[27-28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)酵母β-葡聚糖加鋅復合配方逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺誘導NK 細胞活性下降以及巨噬細胞分泌細胞因子（TNF-α）濃度減少。

腸道黏膜免疫系統(tǒng)是機體最大，也是相對獨立的免疫系統(tǒng)，是機體對抗病原體感染的第 一層屏障，同時，也在維護宿主與外環(huán)境間的黏膜穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮重要作用。有報道證明以成年小鼠為研究對象酵母β-葡聚糖可提高SIgA 含量[4]，而鋅通過調(diào)控小腸上皮細胞，宿主免疫細胞等來維持小腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)，是保持適當腸黏膜厚度的基礎(chǔ)[29]，本研究結(jié)果首次證明了，以幼齡小鼠為實驗對象，酵母β-葡聚糖加鋅復合物可以通過調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫緩解環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)酵母β-葡聚糖加鋅復合配方可以通過逆轉(zhuǎn)免疫器官缺陷，提高免疫細胞數(shù)量，同時增強特異性免疫和非特異性免疫，提高腸道黏膜免疫，來逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺誘導的幼齡小鼠免疫抑制現(xiàn)象，證明β-葡聚糖加鋅復合配方具有較好的調(diào)節(jié)幼齡小鼠免疫機能的作用。