陳亮，龐瑩瑩，張明亮，黃鷺強

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117）

我國的黑米資源豐富[1]，民間具有食用習(xí)慣。黑米所含的蛋白質(zhì)是白米的1.25～1.5倍[2]，賴氨酸含量高[3]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為黑米色素具有固顏保健、防衰緩老等功效[4-6]。黑米表皮含有大量的纖維素和果膠等物質(zhì)[7]不易蒸煮，口感較差。目前產(chǎn)品的開發(fā)僅限于主食產(chǎn)品，充分挖掘中國黑米資源，高效利用其營養(yǎng)價值并開發(fā)新產(chǎn)品，有助于推動黑米加工現(xiàn)代化。

黑米作為輔料加入啤酒釀造過程中可改變啤酒風(fēng)味。黑米中的亞鐵離子、鋅離子等微量元素可有效降低啤酒中雙乙酰的含量[8,9]；黑米中的花青素對啤酒色澤具有改善作用[10]。啤酒揮發(fā)性香氣成分對于啤酒的特征風(fēng)味形成尤其重要，通過分析從香氣、口感方面提高啤酒質(zhì)量有非常重要的意義。本研究對黑米啤酒釀造過程中的主要理化指標(biāo)和揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分析，比較釀造過程的六個代表性階段物質(zhì)變化的差異，為黑米啤酒的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑米，品種為紫兩優(yōu)737，產(chǎn)自寧化縣水茜鎮(zhèn)；麥芽、酒花、S-189酵母均購自濟(jì)南雙麥啤酒物資有限公司。

1.2 試劑

氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、無水乙醇、氯化鈉、環(huán)己酮等，均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

PAL-1 數(shù)顯糖度計，日本ATAGO；ST 3100 pH計，美國OHAUS；Snap 41酒精計，奧地利Anton Paar；集熱式磁力攪拌器，江蘇金壇；固相萃取頭（2 cm-50/30μmDVB/CAR/PDMS），美國Supelco；7890N/5977C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent。

1.4 方法

1.4.1 黑米啤酒的釀造方法

黑米啤酒的釀造工藝參考楊剛[11]的方法略作調(diào)整，分為前期原料處理、粉碎、糊化、糖化、過濾、煮沸、旋沉、發(fā)酵等步驟，如圖1所示。

圖1 黑米啤酒釀造流程圖

⑴ 原料處理：黑米粉碎之前挑去肉眼可見雜質(zhì)，由于其含有豐富的水溶性維生素和色素，避免清洗以減少營養(yǎng)物質(zhì)的流失。

⑵ 粉碎：稱取2.3 kg黑米和20.7 kg麥芽，即將二者以“黑米∶麥芽”為1∶9的加入比例進(jìn)行粉碎，并且要求分別粉碎。黑米經(jīng)過粉碎成粉末狀備用；麥芽在粉碎前10 min需要加入1.5 kg的水濕潤麥芽，待麥芽外表面無明顯水珠時，進(jìn)行粉碎。

⑶ 黑米糊化：首先，需在糊化鍋內(nèi)加入20 L蒸餾水，升溫至50 ℃，啟動糊化鍋攪拌，將粉碎好的黑米投入糊化鍋。50 ℃保溫20 min后，升溫至70 ℃，保溫20 min。

⑷ 糖化：在糖化鍋內(nèi)加入70 L水，升溫至37 ℃后，啟動糖化鍋攪拌，將粉碎好的麥芽、液化酶10 g、氯化鈣20 g和石膏5 g投入糖化鍋。37 ℃保溫20 min，升溫至50 ℃保溫40 min。啟動攪拌，將糊化的黑米泵入糖化鍋內(nèi)，升溫至65 ℃，靜置保溫65 min，進(jìn)行糖化。最后，升溫至78 ℃，保溫10 min。

⑸ 過濾、煮沸、旋沉：糖化結(jié)束后將糖化產(chǎn)物進(jìn)行過濾、回流，至麥汁澄清后，將其煮沸60 min，期間需加入45 g苦味酒花和40 g香味酒花。煮沸后進(jìn)行旋沉處理，進(jìn)一步澄清麥汁，并將澄清好的麥汁冷泵入發(fā)酵罐。

⑹ 發(fā)酵：在泵送麥汁的同時將活化的S-189酵母同時接入發(fā)酵罐，發(fā)酵溫度保持在12 ℃，第3天封罐，第7天第一次排酵母（FY），降溫至9 ℃，期間每隔2 d排一次酵母，最后一次排酵母（LY）開始降溫度至-1 ℃直至成熟，成熟后每隔1 d充1次二氧化碳，共3次，獲得成品（BB）。

1.4.2 糖度、總酸及酒精度的測定

分別在黑米啤酒的代表性發(fā)酵階段，即接種前（BI）、封罐前（BF）、第一次排酵母前（FY）、最后一次排酵母前（LY）、第一次充二氧化碳前（FC）、成品（BB）6個工藝節(jié)點取樣，檢測相應(yīng)的理化指標(biāo)和香氣成分。

1.4.3 糖度、總酸及酒精度的測定

黑米啤酒的糖度、總酸及酒精度參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》進(jìn)行測定。

1.4.4 揮發(fā)性香氣成分的測定分析

揮發(fā)性香氣成分的定性定量分析參照王一冉[12]的方法進(jìn)行測定，通過頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用法測定樣品的揮發(fā)性成分，樣品中香氣各組分經(jīng)計算機譜庫（NEST14）檢索及分析得到。

1.4.4.1 樣品處理

準(zhǔn)確量取10.00 mL黑米啤酒置于20 mL的頂空進(jìn)樣瓶中，加入3.6 g氯化鈉和0.2 mL濃度為1 mL/L的環(huán)己酮(其中環(huán)己酮母液為10 g/L，取50μL加到5 mL待測樣品中，故理論環(huán)己酮最終濃為100 mg/L），加蓋密封，重復(fù)實驗3次；將老化處理后的50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入頂空進(jìn)樣瓶，將纖維頭懸在頂空瓶上方，在溫度為50 ℃的磁力攪拌條件下萃取30 min后，取出萃取頭，立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，于250 ℃解析5 min。

1.4.4.2 色譜、質(zhì)譜條件

⑴ 氣相色譜條件

進(jìn)樣模式：不分流；色譜柱：HP-INNOWAX Polyethylene Glycol（30 m×0.25 mm×0.25μm）。采用氦氣為載氣，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，傳輸線230 ℃。程序初始溫度為40 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升溫至120 ℃，再以1 ℃/min升溫至155 ℃，最后以5 ℃/min的速率上升至220 ℃，保持5 min。

⑵ 質(zhì)譜條件：電子電離（EI）源，電子能量為70 eV，發(fā)射電流100 μA，檢測器電壓為1.4 kV。掃描范圍35～550 amu，離子源溫度為230 ℃。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理

每個實驗平行3次，數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的方式表示。采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0 處理相關(guān)數(shù)據(jù)，用Duncan氏多重比較法對各實驗處理間的差異顯著性進(jìn)行比較分析，圖表制作軟件為origin 8.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米啤酒主要理化指標(biāo)的變化

在啤酒釀造的發(fā)酵各代表性階段分別取樣，測定麥汁濃度、總酸和酒精度并分析比較，結(jié)果見圖2。

圖2 黑米啤酒的主要理化指標(biāo)變化

由圖2可知，黑米啤酒釀造過程中糖度的變化幅度最大，成品中所測得的糖度相對于接種前下了10.7 °Bx。接種前（BI）至封罐前（BF）糖度下降速度最快?？偹釀t呈現(xiàn)前期逐步上升，之后在第一次充二氧化碳（FC）前達(dá)到穩(wěn)定，成品（BB）中總酸度比接種前（BI）上升了7 g/L。接種后酵母代謝產(chǎn)生酒精，到其中最后一次排酵母（LS），成品中酒精度不再上升。

2.2 黑米啤酒揮發(fā)性香氣成分的測定

將黑米啤酒發(fā)酵各代表性階段取樣并進(jìn)行揮發(fā)性香氣成分測定，結(jié)果如表1。

由表1可知，黑米啤酒釀造過程共鑒定出主要香氣成分26種，其中醛類4種，酯類12種，酸類3種，醇類6種，其他化合物1種。在6個階段中，屬于酯類的主要香氣成分物質(zhì)是辛酸乙酯和癸酸乙酯，這些物質(zhì)是黑米啤酒水果香味主要來源；酸類物質(zhì)中辛酸在整個發(fā)酵階段始終占比最大，是黑米啤酒發(fā)酵過程中酸味的主要來源；乙醇作為醇類中最主要香氣物質(zhì)，也是整個黑米啤酒中相對含量占比最多的化學(xué)物質(zhì)，是發(fā)酵過程中酒精氣味逐漸濃郁的主要原因[13]。

表1 黑米啤酒釀造階段主要香氣成分

2.3 黑米啤酒揮發(fā)性香氣成分的比例變化

將黑米啤酒發(fā)酵各代表性階段的揮發(fā)性香氣成分變化繪圖分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，黑米啤酒發(fā)酵6個代表性階段的香氣成分總體接近，但比例不同。

圖3 不同發(fā)酵階段黑米啤酒揮發(fā)性香氣成分比較

接種前（BI）的主要化合物是醛類，且無酸類化合物的存在，而醇類和酯類的相對含量存在輕微的差異。在封罐前（BF），檢測不到醛類物質(zhì)。

接種前（BI）共檢測出7種揮發(fā)性化合物，醛類相對含量約占66.31%，苯乙醛作為主要的醛類揮發(fā)性香氣成分，其相對含量達(dá)到(33.03±0.03)%。

封罐前（BF）共檢測出的16種揮發(fā)性化合物，酯類相對含量64.09%，如癸酸乙酯等共8種物質(zhì)；醇類相對含量27.17%，如苯乙醇等4種；酸類相對含量8.43%，如辛酸等3類物質(zhì)。

第一次排酵母前（FY）檢測出的17種揮發(fā)性化合物，酯類相對含量為46.47%，共包括9種酯類；醇類相對含量為35.68%，共5種物質(zhì)，該階段增加了丙醇，該階段啤酒較前兩次測定酒精味更為刺激[14]；酸類相對含量7.53%。癸酸乙酯相對含量較高（22.16%），具有類似椰子香味，該階段乙醇的相對含量升高達(dá)24.88%。

最后一次排酵母前（LY）共檢測出的17種揮發(fā)性化合物，酯類共有9種，相對含量50.87%，醇類共5種，相對含量37.21%；酸類共3種，相對含量11.95%，

第一次充二氧化碳前（FC）共檢測出16種揮發(fā)性化合物，酯類相對含量8種，相對含50.51%；醇類相對含量有4種，相對含量36.61%；酸類相對含量3種，為12.06%。

成品（BB）共檢測出18種揮發(fā)性化合物，酯類有9種相對含量為46.10%；醇類6種相對含量為43.07%，該階段增加了醇類物質(zhì)2-環(huán)己烯-1-醇；酸類3種相對含量12.75%。

2.4 黑米啤酒揮發(fā)性香氣成分的種類變化

將黑米啤酒發(fā)酵各代表性階段的揮發(fā)性香氣成分變化繪圖分析，結(jié)果見圖4。

圖4 黑米啤酒在不同取樣節(jié)點的風(fēng)味物質(zhì)種類變化

由圖4可知，黑米啤酒在接種后，通過酵母發(fā)酵產(chǎn)生新的風(fēng)味物質(zhì)，主要為酯類、醇類、酸類三類化合物，這與Chengtuo N等的研究結(jié)果相近[15-17]。在封罐前（BF）、第一次排酵母前（FY）、最后一次排酵母前（LY）、第一次充二氧化碳前（FC）和成品（BB）中，主要的酯類化合物、醇類化合物和酸類化合物的種類數(shù)及成分?jǐn)?shù)波動較小，總體穩(wěn)定。各類化合物的占比始終呈現(xiàn)酯類最多，其次是醇類，而后是酸類物質(zhì)，這與周煜等的研究結(jié)果相近[13]。揮發(fā)性酯是黑米啤酒的主要特征香氣成分，酸是啤酒主要呈味物質(zhì)[18]。

3 結(jié)論

揮發(fā)性香氣成分是黑米啤酒的重要品質(zhì)指標(biāo)，本研究共檢出26種揮發(fā)性香氣成分。在釀造過程中，麥汁發(fā)酵，其糖度逐步降低；總酸逐漸升高，隨后呈基本保持穩(wěn)定的趨勢。黑米啤酒不同的釀造階段產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)均以醇類、酯類、酸類為主，揮發(fā)性香氣成分隨著發(fā)酵進(jìn)行大幅增加，酯類增加最為明顯，隨后保持穩(wěn)定，相對含量大小依次為酯類、醇類、酸類。酯類作為啤酒中主要的揮發(fā)性香氣成分，相對含量在發(fā)酵后期穩(wěn)定在了50%左右。