劉 露， 吳文睿， 方頌平， 蒲順昌， 丁 斌，邢 爽， 劉開(kāi)放， 董書(shū)甲， 董 琪， 劉飛翔

(1.亳州學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800；2.養(yǎng)生型配制酒亳州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 亳州 236800)

酒類產(chǎn)品按釀造工藝劃分可分為發(fā)酵酒、蒸餾酒和配制酒。常見(jiàn)得酒類，有白酒，啤酒，黃酒和果酒等，由于所用原料及加工方法不同，各種酒中所含物質(zhì)成分和種類也不盡相同，其中酒中的有機(jī)酸類物質(zhì)具有重要的生物活性和功效，如抗氧化、降血糖及抗腫瘤等作用，關(guān)于酒中酸類物質(zhì)功效及檢測(cè)方法的研究報(bào)道有很多，其中檢測(cè)方法主要有重量法、高效液相色譜法、分光光度法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法和化學(xué)發(fā)光分析法等。分光光度法用于測(cè)定單一酚酸物質(zhì)的量或濃度，主要估算混合物或提取物中總酚酸物質(zhì)含量，不能對(duì)各種酚酸物質(zhì)分別定量；薄層色譜法和柱層析法能對(duì)上述酸類物質(zhì)進(jìn)行分離，成本低廉，但分析時(shí)間長(zhǎng)、只能半定量、重復(fù)性差。本研究建立了一種UPLC-QTOF-MS法檢測(cè)白酒中9種酸類物質(zhì)的方法，該方法前處理簡(jiǎn)單，流動(dòng)相常見(jiàn)易得，可實(shí)現(xiàn)白酒中9種酸類物質(zhì)14 min以內(nèi)的快速分離。同時(shí)本方法的開(kāi)發(fā)也可以為其他酒類中酸類物質(zhì)的檢測(cè)提供一定的理論參考。

1 材料方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；色譜柱：Waters T3柱(50 mm×3 mm×1.8 μm)；電子天平：0.1 mg(梅特勒公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(步琦)；超純水機(jī)(密理博)。

市售白酒；乙腈(CNW色譜純)；酒石酸標(biāo)準(zhǔn)品(CNW，≥99.4%)；蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)品(CNW，≥99.9%);琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品(CNW，≥99.0%)；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(ANPEL，≥99.0%)；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(CNW，≥98.0%)；對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品(ANPEL，≥98.0%)；咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品(CNW，≥98%)；阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品(ANPEL，≥98.0%)；木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品(ANPEL，≥98.0%)。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理方法 樣品經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)除醇后進(jìn)樣。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Waters T3(50 mm×3 mm×1.8 μm)；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相：水-乙腈，流速0.3 mL/min，流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。其中A為乙腈，B為超純水。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.3 質(zhì)譜條件 本實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜條件采用電噴霧-負(fù)離子選擇離子監(jiān)控模式，其他質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

9種酸類物質(zhì)的總離子流圖見(jiàn)圖1。按照保留時(shí)間順序9個(gè)色譜峰分別為酒石酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、沒(méi)食子酸、綠原酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和木犀草素。其中圖2為9種酸類物質(zhì)各自離子流圖，其中a為酒石酸離子流圖，其保留時(shí)間為0.48 min，b為蘋(píng)果酸離子流圖，其保留時(shí)間為0.63 min，c為琥珀酸離子流圖，其保留時(shí)間為1.69 min，d為沒(méi)食子酸離子流圖，其保留時(shí)間為2.76 min，e為綠原酸離子流圖，其保留時(shí)間為6.07 min，f為對(duì)香豆酸離子流圖，其保留時(shí)間為7.96 min，g為咖啡酸離子流圖，其保留時(shí)間為8.42 min，h為阿魏酸離子流圖，其保留時(shí)間為8.66 min，i為木犀草素離子流圖，其保留時(shí)間為10.19 min。由圖可得，9種酚類系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)符合要求，保留時(shí)間附近無(wú)雜質(zhì)干擾。

圖1 9種酸類物質(zhì)總離子流圖

圖2 9種酸類物質(zhì)各自離子流圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

9種酸類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品的母液用超純水稀釋至濃度梯度分別為100、200、300、400、500 μg/L，此濃度梯度下的9種酸類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表3。

表3 9種酸類物質(zhì)的線性回歸方程及R2

2.3 分析方法的驗(yàn)證與樣品檢測(cè)

2.3.1 方法精密度測(cè)試

2.3.1.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 對(duì)同一白酒加標(biāo)樣品進(jìn)行6次檢測(cè)，9種酸類物質(zhì)的含量結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

表4可以看出，白酒樣品中9種酸類物質(zhì)的重復(fù)性試驗(yàn)分別在1.03%～3.58%之間,基本符合要求。

2.3.1.2 重現(xiàn)性試驗(yàn) 對(duì)6個(gè)相同加標(biāo)量下的白酒加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測(cè)，9種酸類物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品重現(xiàn)性測(cè)試結(jié)果

由表5可以看出，白酒樣品中9種酸類物質(zhì)的重現(xiàn)性試驗(yàn)分別在1.20～4.35%之間，基本符合要求。

2.3.2 方法加標(biāo)回收率 加標(biāo)回收率測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表6。

表6可以看出，白酒樣品中9種酸類物質(zhì)的3個(gè)加標(biāo)量下的加標(biāo)回收率在88.99%～112.52%之間，符合分析方法要求。

表6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用電噴霧-負(fù)離子選擇離子(SIR)監(jiān)控模式，建立了一種UPLC-QTOF-MS法檢測(cè)白酒中9種酸類物質(zhì)的方法，該方法前處理簡(jiǎn)單，流動(dòng)相為常見(jiàn)的乙腈和水，方法快速高效，可實(shí)現(xiàn)白酒中9種酸類物質(zhì)14 min以內(nèi)的快速分離檢測(cè)，且樣品檢測(cè)方法精密度試驗(yàn)基本符合要求，本方法的建立也可為其他酒類中酸類物質(zhì)的檢測(cè)提供一定的理論依據(jù)。