趙恒，李婭嫻，史磊，王云飛，丁開云，趙勇，范勝濤，易力

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,云南昆明650118

脊髓灰質(zhì)炎病毒屬無包膜正鏈RNA 病毒,是引起脊髓灰質(zhì)炎的病原體,有Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ3 個血清型,該病毒主要感染3 歲以下嬰幼兒。中國20 世紀(jì)60年代,每年有2 萬 ～4.3 萬名兒童感染脊髓灰質(zhì)炎病毒［1］。1952 年,SALK 等利用野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒研制出世界上首劑脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(inactivated poliovirus vaccine,IPV)［2］。1961 年,SABIN 等成功制成全球第一劑口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗(oral poliovirus vaccine,OPV),并被美國及WHO 批準(zhǔn)上市［3］。

隨著全球范圍內(nèi)大量使用IPV 及OPV,脊髓灰質(zhì)炎病毒得到有效控制,每年感染脊髓灰質(zhì)炎病毒的病例急劇下降,世界上許多地區(qū)已進入無脊髓灰質(zhì)炎時代。但與IPV 相比,使用OPV 會導(dǎo)致一些不良反應(yīng),其中最嚴重的問題是疫苗相關(guān)性脊髓灰質(zhì)炎(vaccine-associated paralytic poliomyelitis,VAPP)及疫苗來源性脊髓灰質(zhì)炎病毒(vaccine derived polio virus,VDPV)。在使用OPV 的國家中,VAPP 發(fā)生的比例較VDPV 要高許多,中國自2010 — 2015 年間報告了 157 例 VAPP,發(fā)生率為(1.0 ～ 2.4)／ 100萬［4］。為保證全球進入無脊髓灰質(zhì)炎時代,同時避免VAPP 及VDPV 的發(fā)生,全球統(tǒng)一使用IPV 是最有效的方法,因此,從2014 年開始,WHO 建議在使用OPV 的國家中至少使用1 劑IPV,即第1 劑使用IPV,后續(xù)使用雙價OPV(bOPV)［5］。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所在2015 年研制出Sabin 株IPV(sIPV),并被CFDA 批準(zhǔn)上市,中國采納WHO 的免疫建議,即第1 劑使用sIPV,后續(xù)使用bOPV 的免疫程序。

相對于OPV,IPV 及sIPV 在控制脊髓灰質(zhì)炎暴發(fā),減少VAPP 及VDPV 發(fā)生等方面具有明顯的優(yōu)勢。但若不能控制好疫苗的滅活過程,保證疫苗中病毒被全部滅活,接種IPV 會給接種者帶來災(zāi)難性后果。在美國IPV 開始使用早期,由Cutter 公司生產(chǎn)的兩批疫苗在接種后導(dǎo)致260 例脊髓灰質(zhì)炎病例發(fā)生,經(jīng)調(diào)查表明,其原因是IPV 在滅活過程中病毒未被徹底滅活,導(dǎo)致接種者感染［6］。因此,在脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的生產(chǎn)過程中,無論IPV 還是sIPV,滅活過程均是保證疫苗安全性的關(guān)鍵步驟,但在生產(chǎn)中連續(xù)多批Sabin 株IPV 的滅活效果驗證及評價尚未見報道。

本研究對中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所sIPV 連續(xù)5 個批次病毒純化液滅活效果進行驗證,同時檢測滅活過程中D 抗原的損失情況,為sIPV 的滅活工藝提供參考,以確保sIPV 疫苗的穩(wěn)定性及安全性。

1 材料與方法

1.1 細胞及病毒 Vero 細胞、人喉癌上皮細胞(Hep-2)及Sabin 株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型病毒均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所提供和保存。

1.2 主要試劑及儀器 甲醛及亞硫酸氫鈉購自美國Sigma 公司；兔抗Sabin 株脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG及Sabin 株脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供；D 抗原標(biāo)準(zhǔn)品由中國食品藥品檢定研究院提供；HRP 標(biāo)記的鼠抗兔IgG 購自美國Thermo 公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司。

1.3 病毒滅活 Sabin 株Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒分別用微載體培養(yǎng)罐培養(yǎng)Vero 細胞擴增,至細胞充分病變后收集培養(yǎng)物,將連續(xù)5 批病毒收獲液純化,加入終濃度為 92.5 μg ／ mL 的甲醛,于 37 ℃滅活12 d。每個型別的病毒分別于滅活前(0 d)及滅活1 ～ 6、9 和 12 d 取樣,滅活樣品加入 92.5 μg ／ mL亞硫酸氫鈉終止滅活反應(yīng)。每個型別病毒連續(xù)取樣5 個批次。

1.4 病毒滴度的檢測 依據(jù)WHO 建議,采用透析膜對滅活后樣品進行透析處理,去除甲醛及亞硫酸氫鈉。分別將0 ～6 d 樣品進行10 倍系列稀釋,加入96 孔板中,100 μL ／ 孔,每個稀釋度重復(fù) 8 孔,加入 Hep-2 細胞懸液,100 μL ／ 孔,置 35.5 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。用倒置顯微鏡觀察細胞病變情況,根據(jù)病變情況采用Reed-Munch 法計算樣品的病毒滴度。并計算每個型別病毒的滅活速率(滅活當(dāng)日與前1 日病毒滴度差)。以滅活時間為橫坐標(biāo),病毒滴度為縱坐標(biāo),繪制病毒滅活動力學(xué)曲線,并進行相關(guān)性及線性回歸分析。

1.5 D 抗原的檢測 采用ELISA 法。將病毒樣品先分別進行2 倍系列稀釋,選取7 個適宜的稀釋度加入包被有抗Sabin 株脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG(Ⅰ型:1 ∶4 000 稀釋,Ⅱ型:1 ∶20 000 稀釋,Ⅱ型:1 ∶6 000 稀釋)的酶標(biāo)板中,100 μL ／ 孔,每個稀釋度重復(fù) 2 孔；加入系列稀釋的 D 抗原標(biāo)準(zhǔn)品,100 μL ／ 孔,每個稀釋度重復(fù)2 孔,2 ～8 ℃過夜；洗滌,加入兔抗Sabin株脊髓灰質(zhì)炎病毒IgG(Ⅰ型:1 ∶80 稀釋,Ⅱ型:1 ∶200 稀釋,Ⅱ型:1 ∶100 稀釋),室溫孵育 2.5 h；洗滌,加入 HRP 標(biāo)記的鼠抗兔 IgG(1 ∶6 500 稀釋),37 ℃孵育1.5 h；洗滌,加入顯色液,37 ℃避光顯色10 min；加入0.01 mol ／ L 硫酸終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀讀取標(biāo)準(zhǔn)品及樣品波長450 ／ 630 的吸光度值,采用四參數(shù)法計算樣品中D 抗原含量,并按下式計算回收率。

D 抗原回收率(%)=(滅活后D 抗原含量 ／ 滅活0 d D抗原含量)× 100%

1.6 病毒滅活驗證 分別將滅活9 及12 d 樣品接種至Hep-2 細胞中,35.5 ℃進行3 次盲傳培養(yǎng),第1次傳代培養(yǎng)21 d,第2 及3 次傳代各培養(yǎng)14 d,每次傳代培養(yǎng)過程中均觀察細胞病變情況。3 次傳代中均無細胞病變,判定病毒被徹底滅活；如有細胞病變,則判定病毒滅活驗證失敗。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。病毒滅活速率采用單因素方差分析,D 抗原回收率采用非參數(shù)檢驗分析,以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病毒滴度 結(jié)果顯示,連續(xù)5 批Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒0 d 樣品平均病毒滴度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F = 0.047,P ＞0.05)。隨著滅活時間延長,樣品的病毒滴度逐漸下降,滅活第3 天下降至0.00 lgCCID50／ mL。見表 1。

表1 Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活不同時間的病毒滴度(lgCCID50 ／ mL, ± SD,n = 5)Tab.1 Poliovirus titers of types Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ after inactivation for various days(lgCCID50 ／ mL, ± SD,n = 5)

表1 Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活不同時間的病毒滴度(lgCCID50 ／ mL, ± SD,n = 5)Tab.1 Poliovirus titers of types Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ after inactivation for various days(lgCCID50 ／ mL, ± SD,n = 5)

時間(d) Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型0 8.77 ± 0.34 8.82 ± 0.26 8.64 ± 0.17 1 5.20 ± 0.96 4.80 ± 0.70 5.12 ± 0.31 2 1.20 ± 1.15 1.15 ± 1.20 2.37 ± 0.46 3 0.00 0.00 0.00 4 0.00 0.00 0.00 5 0.00 0.00 0.00 6 0.00 0.00 0.00

2.2 病毒滅活速率 結(jié)果顯示,3 種型別病毒滅活1 及2 d 的平均滅活速率較快,3 d 的平均滅活速率減慢,但每日滅活速率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P 均＞0.05)。見表2。

2.3 滅活動力學(xué)分析 結(jié)果顯示,Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型病毒滅活0 ～3 d 滅活動力學(xué)曲線均呈直線下降,相關(guān)性分析表明,病毒滅活效果與時間密切相關(guān),相關(guān)系數(shù)(r)分別為-0.995、-0.976 和-0.996,曲線回歸方程分別為Y = -3.301 X + 8.339、Y = -3.011 X +8.209 和 Y = -2.807 X + 8.340,R2分別為 0.991、0.952 和 0.992。見圖 1。

表2 滅活1 ～3 d 的Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型病毒的滅活速率(lgCCID50／d,± SD,n = 5)Tab.2 Inactivation rates of poliovirus of types Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ after inactivation for 1 ～ 3 d(lgCCID50 ／ d, ± SD,n = 5)

表2 滅活1 ～3 d 的Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型病毒的滅活速率(lgCCID50／d,± SD,n = 5)Tab.2 Inactivation rates of poliovirus of types Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ after inactivation for 1 ～ 3 d(lgCCID50 ／ d, ± SD,n = 5)

時間(d) Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型 F P 1 3.58 ± 0.80 4.03 ± 0.89 3.52 ± 0.25 0.777 0.48 2 4.00 ± 1.23 3.65 ± 0.61 2.75 ± 0.32 2.920 0.09 3 1.20 ± 1.15 1.15 ± 1.20 2.37 ± 0.46 2.422 0.13

圖1 Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的滅活動力學(xué)曲線Fig.1 Inactivation dynamic curve of poliovirus of types Ⅰ,Ⅱand Ⅲ

2.4 D 抗原回收率 結(jié)果顯示,Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型病毒滅活12 d 時的D 抗原平均回收率分別為80%、85%和83%。3 種型別病毒的D 抗原均因甲醛滅活而有一定的損失,損失程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F = 0.662,P = 0.718)。見表3。

2.5 病毒滅活驗證結(jié)果 Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型病毒9 及12 d樣品滅活驗證結(jié)果均為陰性,無細胞病變產(chǎn)生,表明病毒被徹底滅活。

表3 Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型病毒滅活樣品的D 抗原回收率(%,±SD,n = 5)Tab.3 Recovery rates of D antigen in poliovirus of types Ⅰ,Ⅱand Ⅲ(%, ± SD,n = 5)

表3 Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型病毒滅活樣品的D 抗原回收率(%,±SD,n = 5)Tab.3 Recovery rates of D antigen in poliovirus of types Ⅰ,Ⅱand Ⅲ(%, ± SD,n = 5)

滅活時間(d) Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型1 0.97 ± 0.02 0.90 ± 0.06 0.96 ± 0.02 2 0.95 ± 0.02 0.90 ± 0.06 0.94 ± 0.02 3 0.93 ± 0.03 0.90 ± 0.06 0.92 ± 0.02 4 0.89 ± 0.04 0.90 ± 0.06 0.91 ± 0.02 5 0.84 ± 0.02 0.89 ± 0.03 0.89 ± 0.02 6 0.83 ± 0.02 0.87 ± 0.03 0.88 ± 0.02 9 0.83 ± 0.01 0.87 ± 0.04 0.85 ± 0.01 12 0.80 ± 0.05 0.85 ± 0.06 0.83 ± 0.06

3 討 論

本研究制備了Sabin 株Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒各連續(xù)5 批純化液,驗證并評價了Sabin 株脊髓灰炎滅活疫苗在生產(chǎn)條件下甲醛對3 種型別病毒的滅活效果。從病毒滅活情況來看,在滅活0 ～3 d內(nèi),3 種型別的病毒滴度均隨著滅活時間的延長而逐漸下降,相關(guān)性分析表明,病毒滅活效果與滅活時間密切相關(guān),且呈明顯負相關(guān),r 分別為-0.995、-0.976 和-0.996。滅活至第3 天,3 種型別病毒滴度均下降至0.00 lgCCID50／ mL,樣品中已檢測不出病毒,與NATHANSON 等［7］研究的野生型脊灰病毒在滅活后72 ～96 h 后可被徹底滅活結(jié)果一致。Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ型病毒0 ～3 d 滅活曲線回歸分析表明,R2分別為0.991、0.952 和0.992,整個反應(yīng)趨于一級反應(yīng)模式,與SALK 等［8］及美國脊髓灰質(zhì)炎疫苗科學(xué)委員會認為甲醛對脊髓灰質(zhì)炎病毒的滅活反應(yīng)服從一級反應(yīng)規(guī)律的結(jié)論一致。甲醛對病毒的滅活反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程,不能單純定義為一級反應(yīng)或其他級反應(yīng),對于疫苗的安全性來說,病毒能被徹底滅活才是保證疫苗安全性的關(guān)鍵問題,因此,滅活曲線所表現(xiàn)出來的規(guī)律也許對滅活工作的指導(dǎo)意義大于實際應(yīng)用意義。在滅活速率上,3 種型別的病毒在滅活第1、2 天的速率均比第3 天快,但同日內(nèi)的滅活速率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05),這可能是由于至第3 天時活病毒量很少,導(dǎo)致滅活速率較慢。滅活9 及12 d 樣品的驗證結(jié)果均顯示陰性,表明第9天時,樣品中經(jīng)檢測不出活病毒,活病毒已被徹底滅活,再延長滅活時間至12 d,疫苗的安全性更有保證。

甲醛對病毒的滅活主要涉及病毒抗原表位的變化及病毒RNA 與衣殼發(fā)生變性兩方面。研究發(fā)現(xiàn),脊髓灰質(zhì)炎病毒經(jīng)甲醛滅活后,抗原位點發(fā)生改變,其中Ⅰ型病毒的抗原位點1 發(fā)生改變,Ⅲ型病毒發(fā)生改變的抗原位點為1 和3,而Ⅱ型病毒的1 ～3 位點均發(fā)生改變,但較輕微［9-11］。本研究中,3 種型別病毒D 抗原回收率在滅活周期中逐漸下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05),抗原在滅活過程中有一定的損失,可能是病毒在滅活中抗原位點發(fā)生改變,進行ELISA檢測時無法檢測到。3 種型別病毒D 抗原回收率均在80%以上,其中Ⅱ及Ⅲ型病毒的D 抗原回收率與THOMASSEN 等［12］的研究結(jié)果(均低于 80%)有差異,可能與后者是在實驗室條件下取得的結(jié)果有關(guān)。

綜上所述,在目前的滅活工藝條件下,Sabin 株3 種型別的病毒均能被穩(wěn)定可靠地滅活,且能收獲含量較高的D 抗原,符合生產(chǎn)需求。