楊嘉賓，陳仲揚(yáng)，周凡琦，余 佳，馬艷妮

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100005)

人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)是研究早期胚胎發(fā)育的細(xì)胞模型。hESCs從囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離而來(lái)，在體外可無(wú)限增殖并可分化成各種不同類型的體細(xì)胞[1]，因而具有極其重要的研究和臨床應(yīng)用價(jià)值。hESCs中基因表達(dá)調(diào)控在多層次之間存在復(fù)雜相互作用，其自我更新調(diào)控機(jī)制在轉(zhuǎn)錄水平得到了廣泛而復(fù)雜的描述[2]，但是缺乏對(duì)RNA運(yùn)輸?shù)绒D(zhuǎn)錄后水平的了解。

真核生物在進(jìn)化上區(qū)別于原核生物的特點(diǎn)之一是有核膜包被的細(xì)胞核，因此mRNA運(yùn)輸是調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物基因表達(dá)途徑中潛在的重要節(jié)點(diǎn)。多種生物過程包括DNA修復(fù)、基因表達(dá)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和造血細(xì)胞分化都可以通過mRNA的選擇性出核來(lái)調(diào)控[3]。在經(jīng)典的mRNA運(yùn)輸途徑中，mRNA加工完成后會(huì)募集出核相關(guān)蛋白，形成具有出核能力的mRNP，與核孔蛋白進(jìn)行對(duì)接，交換信息后通過核孔進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步運(yùn)輸?shù)椒g機(jī)器上進(jìn)行翻譯，在這個(gè)過程中，核孔作為看門人發(fā)揮著重要作用[4]。

RNA結(jié)合蛋白異質(zhì)核核糖核蛋白A3(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3，hnRNPA3)在調(diào)節(jié)RNA的胞質(zhì)運(yùn)輸方面發(fā)揮著非常重要的作用[5]。本研究旨在探究hnRNPA3在hESCs維持自我更新中的生物學(xué)功能，探討其在RNA運(yùn)輸過程中的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞: hESCs為H1細(xì)胞系(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所贈(zèng)送)。

1.1.2 主要試劑: Matrigel(Corning公司)；mTESR1、ReLeSR和Accutase(Stem Cell公司)；NPC抗體(Abcam公司)；protein A磁珠、核質(zhì)分離試劑盒(Thermo Fisher Scientificals公司)；RT-qPCR試劑(TaKaRa公司)；構(gòu)建質(zhì)粒所需的內(nèi)切酶(NEB公司)；Mouse IgG 抗體、AP染色試劑盒(Millipore公司)；Trizol、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)；NPC抗體(Abcam公司)；抗Nup62抗體、抗Nup88抗體、抗HSP90抗體、抗fibrillin抗體、抗tubulin抗體、抗-laminB抗體和抗hnRNPA3抗體(Proteintech公司)，山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗(上海碧云天生物有限公司)；多能分化基因qPCR引物(天一輝遠(yuǎn)測(cè)序公司)；FISH試劑盒：RNAscope? Fluorescent Multiplex Kit、polyA+RNA探針、OCT4 mRNA探針(ACD公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外培養(yǎng)hESCs：將matrigel 鋪至6孔板4 ℃過夜后接種H1克隆。使用mTeSRTM1培養(yǎng)，觀察密度。4～6 d傳代1次：DPBS(Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline)清洗細(xì)胞，加入1 mL ReLeSR室溫靜置1 min后吸凈。將細(xì)胞放至37 ℃孵箱中6～8 min。加入3 mL mTESR1將克隆重懸，傳代至6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)檢測(cè)：收集新鮮的細(xì)胞6×106個(gè)，用1mL含有蛋白酶抑制劑的裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 16 000×g離心15 min，取40 μL裂解液作為input備用，分成兩管裂解液分別加入5 μg NPC抗體和鼠IgG抗體，4 ℃ 旋轉(zhuǎn)孵育過夜。將100 μL蛋白A磁珠分別加入到兩管裂解液中，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育4～6 h。用磁力架吸附磁珠并清洗3次，加SDS上樣緩沖液 50 μL煮沸洗脫蛋白。

1.2.3 分離細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)：使用核質(zhì)分離試劑盒，按照細(xì)胞體積加入適量預(yù)冷Cytoplasmic Extraction Reagent Ⅰ(CER Ⅰ)重懸細(xì)胞,渦旋振蕩15 s，冰上孵育10 min，加入預(yù)冷Cytoplasmic Extraction Reagent Ⅱ(CER Ⅱ)渦旋振蕩5 s，冰上孵育1 min，渦旋振蕩5 s后 16 000×g離心5 min，立即轉(zhuǎn)移上清至干凈的管中，此為細(xì)胞質(zhì)成分。向剩余沉淀部分中加入適量預(yù)冷Nuclear Extraction Reagent(NER),渦旋振蕩15 s后冰上孵育40 min且每10 min振蕩混勻15 s，16 000×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新管中，此為細(xì)胞核成分。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá):提取蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后加入二抗室溫孵育40 min，TBST洗膜后用化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.2.5 shRNA載體的構(gòu)建：通過shRNA干擾片段在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站http://rnaidesigner. Thermofisher.com/ rnaiexpress/以及hnRNPA3的序列,設(shè)計(jì)1條shRNA并在兩端連接相應(yīng)的酶切位點(diǎn)黏性末端,序列由天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成。合成的片段退火，退火得到的片段與pLKO.1載體連接。

1.2.6 克隆形成能力檢測(cè)及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)染色：6孔板每孔5×103個(gè)單細(xì)胞，培養(yǎng)5～7 d，進(jìn)行堿性磷酸酶染色，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞2 min后，PBS洗1次，試劑按照FRV∶Naphthol∶water=2∶1∶1配置好后加入細(xì)胞中，室溫避光放置15 min，去掉染色試劑加PBS洗1次后鏡下觀察。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)RNA: Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA樣品的濃度和純度。M-MLV合成cDNA第一鏈，每個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)總體積為20 μL。程序如下:94 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共 40個(gè)循環(huán)。RT-qPCR用到的引物見表1。

表1 RT-qPCR引物Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.8 RNA 熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization, FISH)技術(shù)：前1 d將細(xì)胞鋪到腔室蓋玻片上過夜。用PBS洗1次后加4%的多聚甲醛固定30 min，PBS洗2次，梯度脫水后用蛋白酶A通透10 min，加RNA探針40 ℃孵育2 h，依次加入擴(kuò)大信號(hào)試劑AMP1、AMP2、AMP3、AMP4孵育，用含有DAPI的封片劑封片，次日用Leica顯微鏡DM6B拍照，使用Cellprofiler軟件進(jìn)行熒光信號(hào)統(tǒng)計(jì)。

1.2.9 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)網(wǎng)站：https://string-db.org/。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 抑制內(nèi)源hnRNPA3的表達(dá)降低了hESCs自我更新能力

在hESCs細(xì)胞中構(gòu)建一條位點(diǎn)特異的shRNA能顯著抑制hnRNPA3蛋白表達(dá)(圖1A)，可用于后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。抑制hnRNPA3的表達(dá)導(dǎo)致hESCs細(xì)胞克隆變小(圖1B)，hESCs克隆形成能力降低(P<0.05)(圖1C)，并且在分子水平上促進(jìn)了分化標(biāo)志基因的表達(dá)(P<0.001)，但多能性標(biāo)志基因RNA水平未發(fā)生明顯的變化(圖1D)。

2.2 hnRNPA3定位在細(xì)胞核中并與核孔復(fù)合物互作

分離hESCs細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)后，可見細(xì)胞質(zhì)標(biāo)志蛋白 HSP90和tubulin 蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中, 細(xì)胞核標(biāo)志蛋白 fibrillin和tubulin 主要定位在細(xì)胞核中，在核質(zhì)分離成功的情況下，RNA結(jié)合蛋白hnRNPA3主要定位在細(xì)胞核中(圖2A)。由于hnRNPA3在過去報(bào)道中參與胞質(zhì)RNA轉(zhuǎn)運(yùn)[9]，選擇核孔復(fù)合物進(jìn)行Co-IP，在核孔主要組分NUP88、NUP62[5]高度富集的情況下，hnRNPA3與核孔復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合(圖2B)。

2.3 抑制內(nèi)源hnRNPA3的表達(dá)減弱了OCT4 mRNA及polyA+ RNA的出核能力

抑制hnRNPA3的表達(dá)后檢測(cè)OCT4 mRNA核質(zhì)分布發(fā)現(xiàn)，WT(wide type) hESCs中OCT4 mRNA 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)hnRNPA3表達(dá)降低后其出現(xiàn)了顯著的核滯留(圖3A)。為探究hnRNPA3對(duì)mRNA出核的調(diào)控是否具有廣譜性，抑制hnRNPA3的表達(dá)后檢測(cè)polyA+RNA 核質(zhì)分布發(fā)現(xiàn)，WT hESCs中polyA+RNA 核質(zhì)均有分布，當(dāng)hnRNPA3表達(dá)降低后在核內(nèi)有明顯聚集，核質(zhì)信號(hào)比增大(圖3B)。

2.4 hnRNPA3與約1/3的已知出核相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合

過去文獻(xiàn)共報(bào)道68個(gè)出核相關(guān)蛋白質(zhì)[5]，從蛋白質(zhì)互作網(wǎng)站預(yù)測(cè)到hnRNPA3與其中近1/3(20個(gè))數(shù)量的蛋白相互作用(圖4A),將其通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行展示(圖4B),其中包括RNA加帽蛋白NCBP1[6]、NCBP2，剪接相關(guān)蛋白SRSF家族[7]，核孔蛋白NUP98[5]、hnRNPA3還與已報(bào)道特異性調(diào)控多能性mRNA出核的THOC2[8]有互作關(guān)系。

圖4 hnRNPA3與出核調(diào)控因子的聯(lián)系Fig 4 A association between hnRNPA3 and the RNA export factors

3 討論

hESC有一個(gè)復(fù)雜的基因表達(dá)程序，控制自我更新和分化之間的微妙平衡。Oct4是hESCs多能性維持必不可少的基因，其表達(dá)的改變會(huì)導(dǎo)致hESCs命運(yùn)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化[9]。雖然轉(zhuǎn)錄可能在基因調(diào)控中起著開關(guān)的作用，但近期研究已經(jīng)開始揭示轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制在維持hESCs狀態(tài)的重要性，如非編碼RNA、選擇性剪接、聚腺苷酸化和RNA穩(wěn)定性[10-12]。因此可能除了轉(zhuǎn)錄外，還存在轉(zhuǎn)錄后模塊與轉(zhuǎn)錄協(xié)同作用，控制hESCs中的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

A.cell localization of marker proteins(Hsp90, tubulin, fibrillin and tubulin) and hnRNPA3 were detected by Western blot；B.enrichment of nucleopore NUP88/NUP62 and the interaction between hnRNPA3 and nucleopore complex were detected by Western blot

A.fluorescence signals of 107 cells in the negative control group and 100 cells in the hnRNPA3 knockdown group(×40), *P<0.001 compared with negative control group; B.fluorescence signals of 170 cells in the negative control group and 221 cells in the hnRNPA3 knockdown group(×40); *P<0.001 compared with negative control group

本研究表明，hnRNPA3對(duì)hESCs自我更新能力的維持有重要的作用，主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面hnRNPA3不影響多能性基因mRNA表達(dá)水平，而是定位在細(xì)胞核中且與核孔復(fù)合物相互作用，調(diào)節(jié)多能性基因OCT4 mRNA出核來(lái)維持hESCs多能性；另一方面hnRNPA3通過抑制分化標(biāo)志基因mRNA水平的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步維持hESCs多能性。然而不能排除hnRNPA3通過其他方式調(diào)節(jié)多能性的可能性，比如從其廣譜性調(diào)節(jié)polyA+RNA出核的表現(xiàn)來(lái)看，除了調(diào)節(jié)多能基因外，可能還通過調(diào)節(jié)其他mRNA的出核來(lái)調(diào)節(jié)多能性。

本研究也探討了hnRNPA3調(diào)控RNA運(yùn)輸?shù)男聶C(jī)制。在經(jīng)典的出核途徑中，mRNA在細(xì)胞核中被RNA結(jié)合蛋白加工成熟后賦予出核能力，歷經(jīng)核質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹匾ǖ篮丝走M(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中被翻譯。RNA結(jié)合蛋白hnRNPA3與20個(gè)已知報(bào)道的出核相關(guān)蛋白互作，這些出核相關(guān)蛋白偶聯(lián)了RNA加工和出核過程。hnRNPA3可能在mRNA的加工時(shí)或者加工完成后募集到mRNA上，幫助募集一部分出核相關(guān)蛋白來(lái)幫助加工進(jìn)而賦予mRNA出核能力，當(dāng)mRNA在出核相關(guān)蛋白的輔助下通過核孔時(shí)，hnRNPA3又可以和核孔互作調(diào)節(jié)核孔的開關(guān)或松弛狀態(tài)使得mRNA順利運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)。之前的研究表明，hnRNPA3還調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中mRNA的運(yùn)輸[13]，可見hnRNPA3在mRNA代謝過程中發(fā)揮了重要的作用。