劉波 ，王少敏 ，袁岸龍

作者單位：孝感市中心醫(yī)院（武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院），a 檢驗(yàn)科，b 消化內(nèi)科，湖北 孝感 432000

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，主要致病因素有酒精性肝炎、肝炎病毒、慢性肝病、遺傳等。肝癌的發(fā)生通常會(huì)經(jīng)過肝炎、肝硬化、肝癌三個(gè)階段。肝臟與腸道在解剖結(jié)構(gòu)上聯(lián)系緊密，二者可形成微生態(tài)循環(huán)，腸道菌群的失調(diào)能夠產(chǎn)生毒素物質(zhì)并進(jìn)入肝腸循環(huán)，從而在肝臟疾病中發(fā)揮重要作用。人體內(nèi)含有微量血氨，血氨是蛋白質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的氨基酸脫氨基而成，對(duì)人體有害，肝臟可將其代謝，合成為尿素或其它含氮化合物隨尿液排出。在肝臟功能受損時(shí)，無法完成上述過程致使血氨濃度升高，因此血氨是一個(gè)反映肝臟功能的重要指標(biāo)。膽堿酯酶是由肝臟合成的非特異性酶，由乙酰膽堿酯酶和擬膽堿酯酶兩部分組成。乙酰膽堿酯酶主要分布于紅細(xì)胞、腦脊液以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的灰質(zhì)中 ；擬膽堿酯酶主要存在于肝臟 、淋巴液和血漿中。血清膽堿酯酶主要指的是擬膽堿酯酶，當(dāng)肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷時(shí)，血清中擬膽堿酯酶將不斷減少，是檢測(cè)肝細(xì)胞合成蛋白功能的靈敏指標(biāo)。但肝癌病人中，腸道菌群與血氨、血清膽堿酯酶水平關(guān)系尚不十分明確，因此本研究通過觀察肝癌病人腸道菌群及血氨、血清膽堿酯酶水平的表達(dá)情況，分析三者關(guān)系，以期為肝癌病人的早期診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取 2017年 8月至 2018年12月孝感市中心醫(yī)院收治的 98例肝癌病人為肝癌組，均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年版）》中的診斷標(biāo)準(zhǔn) ，其中男52例，女46例，年齡（52.74±9.20）歲，范圍為 35～66歲；按照美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第7 版臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期 20例，Ⅱ期 32例，Ⅲ期 25例，Ⅳ期 21例。納入標(biāo)準(zhǔn)：飲食習(xí)慣無偏好，年齡均＞18歲，臨床資料完整；排除標(biāo)準(zhǔn)：所有病人排除合并自身免疫性肝病、遺傳代謝性肝病等其他病因，無合并冠心病、糖尿病、腎臟疾病等。同期肝硬化病人 92例作為對(duì)照組，其中男 48例，女 44例，年齡（51.3±8.7）歲 ，范圍 為 37～65歲 。兩組性別、年齡一般情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。本研究經(jīng)孝感市中心醫(yī)院組織倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（XGLY2018-01-06），樣本的獲取均取得研究對(duì)象的知情同意。

1.2 主要儀器與試劑

全自動(dòng)生化分析儀 OLYMPUS AU640，購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司；血氨檢驗(yàn)試劑，購自北京利德曼生 化股份有限公司；膽堿酯酶酶法試劑，購自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集 分別采集兩組受試者清晨空腹（＞8 h）靜脈血 5 mL，取 3 mL 置于促凝試管中，3 500 r∕min 離心 5 min，吸取血清標(biāo)本置于 Eppendrof 管中，保存在-80 ℃中用以測(cè)定膽堿酯酶；余下 2 mL靜脈血置于檸檬酸鹽抗凝試管中，用以檢測(cè)血氨，應(yīng)在 2 h 內(nèi)完成測(cè)定。同時(shí)分別采集兩組受試者的新鮮糞便 0.5 g，進(jìn)行微生物培養(yǎng)，操作在 15 min 內(nèi)完成。

1.3.2 微生物培養(yǎng) 收集的新鮮糞便用稀釋液稀釋至 10，滴注法接種于選擇培養(yǎng)基上。對(duì) 10 種具有代表性的腸道優(yōu)勢(shì)菌做定性定量培養(yǎng)，其中厭氧菌 6 種（擬桿菌、乳桿菌、真桿菌、雙歧桿菌、消化球菌、梭菌），需氧菌 4 種（酵母菌、腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌）。厭氧菌在厭氧罐中 37 ℃培養(yǎng) 72 h，需氧菌在恒溫培養(yǎng)箱中 37 ℃培養(yǎng) 24～48 h。選取菌落數(shù)在 30～300 的培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù) ，同一稀釋度取平均數(shù)。

1.3.3 連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)血氨含量 將置于檸檬酸鹽抗凝試管中的 2 mL 靜脈血，3 000 r∕min 離心 10 min，選用全自動(dòng)生化分析儀，以連續(xù)檢測(cè)法對(duì)血氨水平進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行，并確保在 2 h 內(nèi)完成檢測(cè)。血氨正常參考值為 10～47 μmol∕L。

1.3.4 假性膽堿酯酶速率法檢測(cè)膽堿酯酶的表達(dá)從-80 ℃取出保存的血清標(biāo)本，按照膽堿酯酶試劑盒的操作說明進(jìn)行檢測(cè)，使用全自動(dòng)生化分析儀在405 nm 處連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度的變化，其下降速度與樣本膽堿酯酶的活力呈正比。膽堿酯酶的正常參考值為 3 800～13 000 U∕L。

2 結(jié)果

2.1 兩組腸道菌比較

肝癌組病人腸道內(nèi)擬桿菌、乳桿菌、真桿菌、雙歧桿菌、消化球菌、酵母菌、腸桿菌及葡萄球菌均比對(duì)照組減少（

P

＜0.05）。見表1。

2.2 兩組血氨、血清膽堿酯酶水平比較

肝癌組血氨水平明顯高于對(duì)照組（

P

＜0.05），而血清膽堿酯酶水平則明顯低于對(duì)照組（

P

＜0.05）。見表2。

2.3 肝癌病人不同臨床分期血氨、血清膽堿酯酶水平比較

肝癌病人不同臨床分期血氨、血清膽堿酯酶水平比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，肝癌Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ期病人血氨水平明顯高于Ⅰ期病人，血清膽堿酯酶水平明顯低于Ⅰ期病人（

P

＜0.05）；肝癌Ⅳ、Ⅲ期病人血氨水平顯著高于Ⅱ期病人，血清膽堿酯酶水平顯著低于Ⅱ期病人（

P

＜0.05）；肝癌Ⅳ期病人血氨水平明顯高于Ⅲ期病人，血清膽堿酯酶水平明顯低于Ⅲ期病人（

P

＜0.05）。見表3。

表1 兩組腸道菌比較∕（lgCFU∕g

表2 兩組血氨、膽堿酯酶水平比較

表3 肝癌病人 98例不同臨床分期血氨、血清膽堿酯酶水平比較

2.4 肝癌病人腸道菌與血氨、血清膽堿酯酶的相關(guān)性

肝癌病人體內(nèi)的擬桿菌、雙歧桿菌、酵母菌、腸桿菌及葡萄球菌與血氨水平均呈負(fù)相關(guān)（

P

＜0.05），與血清膽堿酯酶水平均呈正相關(guān)（

P

＜0.05）；而乳桿菌、真桿菌及消化球菌與血氨水平、血清膽堿酯酶水平均無顯著相關(guān)性（

P

＞0.05）。見表4。

3 討論

肝癌發(fā)病率位居所有腫瘤疾病第6 位，病死率高居第3 位。肝癌就診時(shí)多為中晚期，治療效果較差。而肝癌的發(fā)病機(jī)制與病因尚未明確，其發(fā)生發(fā)展可能與病毒性肝炎、肝硬化有緊密聯(lián)系。

表4 肝癌病人 98例腸道菌與血氨、血清膽堿酯酶的相關(guān)性

成人腸道中正常情況下定植 約 4×10個(gè)微生物，其中大部分為厭氧菌，構(gòu)成人體最重要的微生態(tài)系統(tǒng)。菌群平衡對(duì)腸道免疫和全身穩(wěn)態(tài)有重要作用，一旦該平衡被打破，將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重病變。大量研究證實(shí)，恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡，改善菌群失調(diào)及維持腸道屏障功能對(duì)疾病的治療具有重大意義。研究表明，腸道菌群在肝臟疾病中主要通過炎癥信號(hào)通路起作用，由腸道細(xì)菌、肝臟和免疫系統(tǒng)間的相互作用觸發(fā)。肝癌病人的門脈高壓會(huì)造成胃腸道淤血、水腫，影響胃的消化吸收，進(jìn)而為腸道細(xì)菌的繁殖提供適宜環(huán)境；肝功能受損導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成下降，胃腸道淤血、水腫進(jìn)一步加重，神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)可抑制胃腸黏膜的吸收、分泌功能，以上因素均可對(duì)腸道屏障功能造成損害，增加腸黏膜通透性，引發(fā)腸道菌群的易位。而腸道菌群及其代謝產(chǎn)物通過肝腸循環(huán)進(jìn)入肝臟，激活肝臟相關(guān)免疫細(xì)胞或與其表面 Toll 樣受體結(jié)合，釋放炎性因子，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，加速肝纖 維化和肝硬化的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致疾病惡化，最終形成肝癌。本研究對(duì)肝癌病人體內(nèi)的 10 種腸道菌進(jìn)行體外培養(yǎng)，與對(duì)照組相比，肝癌組病人腸道內(nèi)擬桿菌、乳桿菌、真桿菌、雙歧桿菌、消化球菌、酵母菌、腸桿菌以及葡萄球菌均比對(duì)照組減少，提示肝癌病人的部分腸道菌被抑制，腸道菌群發(fā)生改變，可能造成肝功能損傷。

肝細(xì)胞功能損傷可導(dǎo)致鳥氨酸循環(huán)在肝內(nèi)代謝受阻，從而使腸道中的 氨無法有效的轉(zhuǎn)化成尿素，隨尿液排出體外；或因門-體側(cè)支循環(huán)的建立，腸道中的氨直接進(jìn)入體循環(huán)而不經(jīng)由肝臟進(jìn)行解毒，最終導(dǎo)致血氨含量上升。研究證明，肝硬化病人門靜脈血壓增高，造成食管靜脈曲張破裂出血，血紅蛋白在腸道中分解導(dǎo)致氨水平升高。有研究表明，肝硬化病人的血氨含量與肝功能分級(jí)有一定聯(lián)系，血氨水平越高，肝功能分級(jí)越高。本研究結(jié)果顯示，肝癌病人血氨水平遠(yuǎn)高于對(duì)照組，且隨著臨床分期的增高，血氨水平呈上升趨勢(shì)，提示肝癌病人可能由于食管靜脈出血或肝細(xì)胞損傷等原因引起血氨水平升高，但具體尚需進(jìn)一步研究。

膽堿酯酶是一種非特異性酯酶，肝臟是其合成的唯一場(chǎng)所。肝細(xì)胞受損或變性壞死、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或纖維結(jié)締組織增生，均可造成肝臟合成酶的能力下降，導(dǎo)致膽堿酯酶活性及血清膽堿酯酶濃度降低，因此檢測(cè)血清中膽堿酯酶水平對(duì)肝臟疾病的診斷具有較高的敏感性。膽堿酯酶是肝臟病變后唯一表達(dá)下降的酶，且不受輸血及血漿蛋白的影響，可作為判斷肝病嚴(yán)重程度的指標(biāo)，有利于肝臟疾病的診斷。研究顯示，肝臟病變程度與血清膽堿酯酶之間呈負(fù)相關(guān)，即肝功能分級(jí)越高，血清膽堿酯酶水平越低。本研究結(jié)果顯示，肝癌病人血清膽堿酯酶水平遠(yuǎn)低于對(duì)照組，且隨著臨床分期的增高，血清膽堿酯酶水平呈下降趨勢(shì)，提示肝癌病人可能由于肝細(xì)胞受損或變性壞死導(dǎo)致血清膽堿酯酶水平降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肝癌病人體內(nèi)的擬桿菌、雙歧桿菌、酵母菌、腸桿菌及葡萄球菌與血氨水平呈負(fù)相關(guān)，與血清膽堿酯 酶水平呈正相關(guān)，提示以上 5 種腸道菌的變化可能會(huì)影響血氨及血清膽堿酯酶的水平。

綜上所述，腸道菌群數(shù)量下降、血氨水平升高及血清膽堿酯酶水平降低可能共同參與肝癌發(fā)生，臨床觀察三者變化可能有利于肝癌的早期診療。但本研究選取的腸道菌種類較少，研究不夠全面，下一步應(yīng)擴(kuò)大樣本繼續(xù)研究。