郭慧，劉鵬飛

作者單位：湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 株洲 412000

肝癌是腫瘤相關(guān)性死亡的重要原因之一，我國(guó)是肝癌的高發(fā)區(qū)，每年有 11～13 萬(wàn)人死于肝癌，占全球肝癌死亡的 50% 以上；目前以手術(shù)切除為主的綜合治療是肝癌的主要治療手段，但其治療效果并不理想。人參皂苷是中藥材人參的主要活性成分之一，具有提高免疫、抗病毒、抗炎和抗腫瘤等廣泛的藥理作用；人參皂 苷 Rg5 是稀有人參 皂苷之一，可 通過影響腫瘤細(xì)胞增殖和凋 亡等抑制宮頸癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但其對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響并不清楚。因此，本研究通過常規(guī)生物學(xué)手段觀察人參皂苷 Rg5 對(duì)肝癌 HepG2細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、周期和凋亡的影響，并探討其可能的分子機(jī)制，以揭示其對(duì)肝癌細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人參皂苷 Rg5（純度 98%）購(gòu)于維克奇生物科技公司，洛斯維公園紀(jì)念所 1640 培養(yǎng)基（RPMI1640）、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó) Gibco 公司，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）試劑和二甲基亞砜購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司，RIPA 細(xì)胞裂解液購(gòu)于上海碧云天公司，兔抗蛋白激酶 B（AKT）、磷酸化蛋白激酶 B（p-AKT）、B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶 9（MMP-9）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體購(gòu)于美國(guó) CST 公司，鼠抗細(xì)胞周期蛋白 D1（cyclin D1）單克隆抗體購(gòu)于美國(guó) Santa Cruz 公司，辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔或鼠 IgG 抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、Braford 蛋白含量檢測(cè)試劑盒和電化學(xué)發(fā)光法（ECL）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京凱基生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將來自中科院上海細(xì)胞庫(kù)的肝癌HepG2 細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，接種于含 100 U∕mL 青霉素鏈霉素雙抗和10% 胎牛血清的RPMI1640 培 養(yǎng) 基中，并在溫度為 37 ℃、濕度飽和、體積分?jǐn)?shù)為 5% 二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。每 2 天更換一次細(xì)胞液，定期觀察。待細(xì)胞鋪滿瓶底 85% 時(shí)，加入0.25% 胰蛋白酶消化，并按照 1∶3 比例傳代。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為生長(zhǎng)狀況良好的第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG2 細(xì)胞以每孔 2×10個(gè)細(xì)胞種植于 96 孔細(xì)胞板上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜。以 RPMI1640 培養(yǎng)基將人參皂苷 Rg5 的濃度調(diào)整為 10、20、40、80 和 160 μmol∕L。次日，棄細(xì)胞培養(yǎng)液后，加入終濃度為 10、20、40、80 和 160 μmol∕L 人參皂苷 Rg5，并以不含人參皂苷 Rg5 的細(xì)胞作為對(duì)照（0 μmol∕L）組，另設(shè)置不含細(xì)胞的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組，每組設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔。分別在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24、48 和 72 h 后，每孔加入 20 μL 濃度為 5 mg∕mL 的 MTT 溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 4 h 后，加入 100 μL 二甲基亞砜震蕩反應(yīng)至 MTT 結(jié)晶完全溶解。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各處理組細(xì)胞的吸光度（OD）值，并以（藥物組 OD-空白組 OD）∕（對(duì)照組 OD-空白組 OD）×100% 的值表示各組細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.4 細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 的HepG2 細(xì)胞以每孔 100 μL（濃度 10個(gè)∕毫升）接種于24 孔細(xì)胞板上，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜后，加入終濃度為 0、40、80 和 160 μmol∕L 人參皂苷 Rg5，每組設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，并制成濃度為 10個(gè)∕毫升細(xì)胞懸液。 侵襲實(shí)驗(yàn)：首先 ，以 50 μL Matrigel 溶液包被Transwell 小室的聚碳酸酯微孔膜，并在室溫下充分融合凝固（遷移實(shí)驗(yàn)中無需該步驟）。在小室下層加入 600 μL 含血清培養(yǎng)基，上層中加入制備的細(xì)胞懸液 100 μL。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h 后，取出小室。拭去上層內(nèi)殘留的細(xì)胞，分別以甲醛固定、結(jié)晶紫染色 15 min。洗去染色液后，自然晾干，在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取 3 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)（即侵襲細(xì)胞數(shù)）。遷移實(shí)驗(yàn)：除了不需對(duì) Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜進(jìn)行包被外，其余步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)的步驟相同。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.5 細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 的HepG2 細(xì)胞以每孔 2×10個(gè)細(xì)胞接種至 6 孔細(xì)胞板上，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。加入終濃度為 0、40、80和 160 μmol∕L 人參皂苷 Rg5，每組設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱內(nèi)處理 48 h 后，以胰蛋白酶消化收集各處理組細(xì)胞，并將其分為兩份，一份用以細(xì)胞周期檢測(cè)，一份用以細(xì)胞凋亡檢測(cè)。具體操作步驟參照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.6 AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG2 細(xì)胞以每孔 2×10個(gè)細(xì)胞接種至 6 孔細(xì)胞板上，孵育過夜后，加入終濃度為 0、40、80 和160 mol∕L 人參皂苷 Rg5，每孔設(shè)置 3 次復(fù)孔。孵育48 h 后，胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞后，1 200 r∕min 低溫離心 5 min，棄上清，加入RIPA 細(xì)胞裂解液冰上裂解提取總蛋白，并以 Braford法檢測(cè)總蛋白的濃度。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，混勻后，置于沸水浴中變性 5 min。在 SDSPAGE 凝膠孔中，加入各處理組蛋白樣品，40 mA 恒流電泳 2 h。以濕轉(zhuǎn)法將蛋白樣品轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上后，浸泡于含 5% 脫脂奶粉的封閉液中封閉 1 h。以一抗工作液（AKT 1∶1 000、p-AKT 1∶1 000、cyclin D1 1∶500、MMP-9 1∶800、Bcl-2 1∶1 000 和 GAPDH 1∶1 000）4 ℃孵育過夜后，置于二抗工作液（1∶2 000）中室溫孵育 1 h。 經(jīng) ECL 發(fā)光液顯影曝光后 ，以GAPDH 為內(nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)分析各組細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷 Rg5 對(duì)肝癌 HepG2 細(xì) 胞增殖的影響

在 24 h 作用時(shí)間下，40、80 和 160 μmol∕L 人參皂苷 Rg5 的細(xì)胞存活率較對(duì)照（0 μmol∕L）組明顯降低（

P

＜0.05）；在 48 h 作用時(shí)間下，20、40、80 和 160 μmol∕L 人參皂苷 Rg5 的細(xì)胞存活率均顯著低于對(duì)照（0 μmol∕L）組（

P

＜0.05）；而在 72 h 作用時(shí)間下，不同濃度的人參皂苷均可使 HepG2 細(xì)胞存活率低于 0 μmol∕L 組（

P

＜0.05）。計(jì)算得出，人參皂苷 Rg5 作用HepG2 細(xì)胞 24、48 和 72 h 后的半數(shù)抑制濃度（IC）值分別為 138.60、91.12 和 46.92 μmol∕L。故后續(xù)選用 40、80 和 160 μmol∕L 的人參皂苷 Rg5 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見表1。

2.2 人參皂苷 Rg5 對(duì)肝癌 HepG2 細(xì)胞侵襲、遷移的影響

與對(duì)照（0 μmol∕L）組相 比 ，40、80 和 160 μmol∕L 處理組中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均明顯降低（

P

＜0.05）；且 80 和 160 μmol∕L 處理組顯著低于40 μmol∕L 處理組（

P

＜0.05）；但 160 μmol∕L 處理組與80 μmol∕L 處理組相比，侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見圖1、表2。

表1 不同濃度人參皂苷 Rg5 處理后各組肝癌 HepG2 細(xì)胞的存活率∕（%，）

表2 各組肝癌 HepG2 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)∕（個(gè)，）

2.3 人參皂苷 Rg5 對(duì)肝癌 HepG2 細(xì)胞周期的影響

人 參皂苷 Rg5 處 理后 HepG2 細(xì)胞在 G2∕M 期 的百分比與對(duì)照（0 μmol∕L）組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。與對(duì)照（0 μmol∕L）組相比，40、80 和160 μmol∕L 人參皂苷 Rg5 可使 HepG2 細(xì)胞在 G0∕G1期的百分比明顯升高（

P

＜0.05），而在 S 期的百分比明顯降低（

P

＜0.05）；且 80 和 160 μmol∕L 人參皂苷Rg5 引起的細(xì)胞周期分布的變化明顯大于 40 μmol∕L（

P

＜0.05），但 80 μmol∕L 和 160 μmol∕L 處理組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表3。

表3 各組肝癌 HepG2 細(xì)胞的周期分布和凋亡率∕（%，）

2.4 人參皂苷 Rg5 對(duì)肝癌 HepG2 細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照（0 μmol∕L）組相比，不同濃度的人參皂苷 Rg5 處理后 HepG2 細(xì)胞凋亡率均明顯升高（

P

＜0.05）；且 80 和 160 μmol∕L 處理組細(xì)胞凋亡率明顯高于 40 μmol∕L 處理組（

P

＜0.05）；但是，160 μmol∕L 處理組細(xì)胞凋亡率與 80 μmol∕L 處理組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見圖2、表3。

圖1 不同濃度人參皂苷Rg5對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞侵襲、遷移的影響（結(jié)晶紫染色×400）：A為Transwell檢測(cè)侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B為Transwell檢測(cè)遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度人參皂苷Rg5處理后各組肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡情況

2.5 人參皂苷 Rg5 對(duì)肝癌細(xì)胞中 AKT、p-AKT、cy-

clin D1、MMP-9 和 Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照（0 μmol∕L）組相比，人參皂苷 Rg5 處理后 HepG2 細(xì)胞中 AKT 蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），但 40、80 和 160 μmol∕L 處理組細(xì)胞中 p-AKT、cyclin D1、MMP-9 和 Bcl-2 的表達(dá)水平較對(duì)照（0 μmol∕L）組均明顯降低（

P

＜0.05），且高濃度 80 和 160 μmol∕L 的作用強(qiáng)度明顯大于低濃度 40 μmol∕L（

P

＜0.05）；而 160 μmol∕L 和 80 μmol∕L 的作用效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見圖3、表4。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)不同濃度人參皂苷 Rg5 處理的肝癌 HepG2細(xì)胞 AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

表4 各組肝癌 HepG2 細(xì)胞中 AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

3 結(jié)論

人參是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材之一，含有豐富的皂苷類成分，其中人參皂苷 Rg3 已被作為腫瘤新生血管抑制劑批準(zhǔn)上市，而人參皂苷 Rg5 在腫瘤中的研究還處在實(shí)驗(yàn)階段。有學(xué)者在肺癌中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg5 具有一定的抗癌活性，可通過調(diào)控與凋亡相關(guān)的鈣調(diào)素樣蛋白、嘌呤核苷磷酸化酶、轉(zhuǎn)醛酶、膽綠素還原酶、醛脫氫酶、二氫蝶啶還原酶和活性反應(yīng) DNA 結(jié)合蛋白-43 的表達(dá)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。Cui 等在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg5 通過滅活 AKT 信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并下調(diào) Bcl-2 的表達(dá)。有研究在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg5 可通過下調(diào)周期相關(guān)蛋白 cyclin D1、CyclinE2、周期素依賴性激酶 4（CDK4）和上調(diào)p21、p53 等的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于 G0∕G1，抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，李為等在胃癌中指出，人參皂苷 Rg5 可通過調(diào)控 miR-125b 表達(dá)抑制癌細(xì)胞侵襲和遷移。本研究以不同濃度的人參皂苷 Rg5 作用于肝癌 HepG2 細(xì)胞不同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg5 可呈時(shí)間-劑量依賴性抑制 HepG2細(xì)胞增殖；此外，還發(fā)現(xiàn)人參皂苷 Rg5 可誘導(dǎo) HepG2細(xì)胞周期阻滯于 G0∕G1 期，抑制 HepG2 細(xì)胞侵襲、遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。該結(jié)果與人參皂苷 Rg5 在乳腺癌、胃癌中的抗腫瘤作用相吻合。這提示人參皂苷 Rg5 可通過抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗肝癌的作用。

磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）∕AKT 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，AKT 是 PI3K 下游的調(diào)節(jié)分子，活化的 AKT 以磷酸化形式存在，可通過影響下游轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 MMP-9、凋亡相關(guān)基因 Bcl-2、增殖相關(guān)基因 cyclin D1 等的表達(dá)，在調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡過程在發(fā)揮著重要作用，其過度活化與包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Liu 等和 Zhang 等分別在乳腺癌和食管癌中證實(shí)人參皂苷 Rg5 可通過抑制 AKT 信號(hào)通路的活化發(fā)揮抗腫瘤作用。為了進(jìn)一步探討人參皂苷 Rg5 抗肝癌的分子機(jī)制，本研究采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg5 可使肝癌 HepG2 細(xì)胞中AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白 p-AKT、cyclin D1、MMP-9 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平明顯降低。這提示，人參皂苷Rg5 可能通過抑制 AKT 信號(hào)通路活化影響肝癌HepG2 細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡過程，進(jìn)而發(fā)揮抗肝癌的作用。

綜上所述，人參皂苷 Rg5 可抑制肝癌 HepG2 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制 AKT 信號(hào)通路的活化有關(guān)。該結(jié)果從細(xì)胞水平上闡述了人參皂苷 Rg5 對(duì)肝癌的作用，為人參皂苷 Rg5 在肝癌方面的深入研究奠定了基礎(chǔ)，也為肝癌的治療提供了新的線索。