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        花生油中黃曲霉毒素B1高效液相色譜 檢測方法的探索與研究

        2021-06-16 07:44:42唐國芳
        現(xiàn)代食品 2021年7期
        關(guān)鍵詞:親和柱花生油黃曲霉

        ◎ 唐國芳

        (貴州省黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測中心,貴州 凱里 556000)

        黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是常見的食品污染物之一,其危害極大。黃曲霉毒素有很多種,其中黃曲霉毒素B1(AFTB1)毒性最強(qiáng),它的毒性比砒霜強(qiáng)幾十倍,對肝臟有嚴(yán)重的損傷,是Ⅰ類致癌物。AFTB1化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定,很難溶于水,高溫高壓對它的破壞程度也很小,接近300 ℃時才開始裂解,所以一般的烹調(diào)方法對它基本上沒有作用。花生是容易感染黃曲霉的農(nóng)作物之一,黃曲霉毒素對花生具有極高的親和性。黃曲霉的侵染和黃曲霉毒素的產(chǎn)生不僅發(fā)生在花生的種植過程中,而且在加工過程中也會產(chǎn)生。黃曲霉菌廣泛存在于土壤中,菌絲生長時易產(chǎn)生毒素,而生長在土壤之中的花生最容易感染黃曲霉毒素。制作花生油的過程中,大量的花生經(jīng)過壓榨,其中霉變花生所含的黃曲霉毒素很可能經(jīng)由這個過程出現(xiàn)在花生油中。

        國家市場監(jiān)督管理總局規(guī)定,黃曲霉毒素B1作為重點(diǎn)食品污染物是大部分食品的必檢項(xiàng)目之一?!妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)[1]標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,花生(油)和玉米(油)的黃曲霉毒素B1限值均為20 μg kg-1,在所有黃曲霉毒素B1限量的食物中限值最高。

        本文根據(jù)中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價中心下達(dá)的能力驗(yàn)證計(jì)劃——《花生油中黃曲霉毒素B1的測定》(ACAS-PT833—2019),以中檢院提供的盲樣為樣品,以《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》(GB 5009.22—2016)[2]標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù),通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件來探索花生油中黃曲霉毒素B1的檢測方法,以加標(biāo)測回收率來驗(yàn)證方法的可行性。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        Agilent1260高效液相色譜儀,熒光檢測器,光化學(xué)柱后衍生器,3 mL Pribolab黃曲霉毒素總量免疫親和柱。

        甲醇-水(70+30);磷酸鹽緩沖溶液(PBS):8.00 g氯化鈉、1.20 g磷酸氫二鈉、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化鉀,用900 mL水溶解,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4,用水定容至1 000 mL;1% Triton X-100(或吐溫-20)的PBS: 取10 mL Triton X-100, 用PBS定 容 至1 000 mL。所用試劑均為分析純。

        黃曲霉毒素B1(AFTB1)標(biāo)準(zhǔn)溶液,標(biāo)準(zhǔn)值2.0 μg·mL-1,由國家農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所提供,編號SB05-195-2008。

        1.2 分析步驟

        1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

        將AFTB1標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配制成200 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,再用初始流動相配制成濃度為0.625 ng·mL-1、1.250 ng·mL-1、2.500 ng·mL-1、5.000 ng·mL-1、10.000 ng·mL-1、20.000 ng·mL-1、40.000 ng·mL-1的 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

        1.2.2 樣品前處理

        準(zhǔn)確稱取5 g樣品(精確至0.001 g)于50 mL離心管中,準(zhǔn)確加入20 mL甲醇-水溶液(70+30)提取液,渦旋混勻,置于渦旋振蕩器中振蕩20 min,在4 000 r·min-1下離心10 min,準(zhǔn)確移取4 mL上清液,加入40 mL左右1% Triton X-100(吐溫-20)的PBS,混勻,待過柱凈化。

        1.3 樣品的凈化

        1.3.1 免疫親和柱的準(zhǔn)備

        將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。

        1.3.2 試樣的凈化

        免疫親和柱內(nèi)液體放棄后,將1.2.2處理好的樣品移至50 mL注射筒中,調(diào)節(jié)下滴速度,控制樣液以1~3 mL·min-1的速度穩(wěn)定下滴,待樣液滴完后,往注射器筒內(nèi)分兩次加入20 mL水,以穩(wěn)定的流速淋洗免疫親和柱,待水滴完后,用真空泵抽干親和柱,最后用4 mL甲醇分4次洗脫,控制洗脫速度在1~3 mL·min-1,收集洗脫液,在500 ℃下用氮?dú)饩従彺抵两?,用初始流動相定容? mL,渦旋30 s,過0.22 μm有機(jī)濾膜,上機(jī)檢測。

        1.4 加標(biāo)樣品的處理

        稱取空白樣品5 g(精確至0.001 g),準(zhǔn)確加入0.5 mL 40 ng·mL-1的黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,和樣品一起平行處理、凈化、上機(jī)檢測算回收率。

        1.5 柱后光化學(xué)衍生法液相色譜參考條件

        流動相:A相甲醇,C相乙腈,D相水(體積比30∶10∶60);色譜柱:Agilent Poroshell 120 C184.6×150 mm;流速:1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量:30 μL;柱溫:400 ℃;激發(fā)波長:360 nm;發(fā)射波長:440 nm。

        1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

        系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由低到高濃度依次進(jìn)樣檢測,以峰面積為縱坐標(biāo)、以樣品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.7 樣品的測定

        試樣中AFTB1的含量計(jì)算公式為:

        式(1)中:X-試樣中AFTB1的含量,單位為μg·kg-1;C-進(jìn)樣溶液中AFTB1按照外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)的濃度,單位為ng·mL-1;V1-試樣提取液體積,單位為mL;V3-樣品經(jīng)免疫親和柱凈化洗脫后的最終定容體積,單位為mL;V2-用于免疫親和柱的分取樣品體積,單位為mL;m-樣品稱樣量,單位為g。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 結(jié)果

        得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如圖1所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,相關(guān)線性系數(shù)達(dá)到0.999 9,線性范圍在0.625 ~ 40.000 ng·mL-1。

        圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

        空白樣品加標(biāo)回收,回收率達(dá)到81.1%??瞻准訕?biāo)圖譜圖如圖2所示。

        用同樣的條件進(jìn)黃曲霉菌毒素G1、G2、B1、B2的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分離效果很好,如圖3所示。

        圖2 空白加標(biāo)圖譜圖

        圖3 黃曲霉菌毒素G1、G2、B1、B2色譜圖

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)中檢院測試評價中心審核,與測試中心通報(bào)的指定值比較,兩個樣品Z值分別為0.1和0.2,獲得滿意結(jié)果。

        2.2 實(shí)驗(yàn)分析

        2.2.1 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件

        GB 5009.22—2016的分析方法中流動相甲醇、乙腈、水的比例25∶25∶50,經(jīng)過探索,將甲醇、乙腈、水的比例調(diào)整為30∶10∶60,能讓AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG14種物質(zhì)達(dá)到理想的分離狀態(tài)。

        在樣品前處理時加入吐溫試劑時,國標(biāo)添加量為23 mL,為了降低緩沖液中甲醇的濃度,本實(shí)驗(yàn)添加量為40 mL。AFTB1易溶于甲醇,先前上柱的提取液要棄去,讓提取液中提取出來AFTB1抗源與免疫親和柱中的AFTB1抗體能夠更充分有效的結(jié)合在一起。

        洗脫的甲醇與國標(biāo)相比多了2 mL,這樣雖然增加了氮吹的時間,但能夠充分保證免疫親和柱與抗體結(jié)合的黃曲霉毒素B1能夠完全洗下來,提高回收率。

        2.2.2 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

        免疫親和柱從冰箱中拿出來要放到室溫至少要在0.5 h以上。免疫親和柱內(nèi)真菌毒素的抗體在20~25 ℃時活性最強(qiáng),所以樣品上柱凈化處理的環(huán)境溫度要控制在20~25 ℃。最后用甲醇洗脫時,第1 mL甲醇加進(jìn)去后,先把免疫親和柱的下端口堵住,溫育幾分鐘。氮吹結(jié)束用1 mL甲醇定容時要充分均勻,讓氮吹管壁上的黃曲霉毒素B1充分溶于甲醇中[3]。

        做加標(biāo)回收,不要馬上加標(biāo)提取,充分混勻放置過夜,讓標(biāo)液有充分的時間和樣品混合,增加基質(zhì)的干擾,增加提取的難度。

        黃曲霉毒素B1一般在中性溶液中較穩(wěn)定,但在強(qiáng)酸性溶液中稍有分解,在pH 9~10的強(qiáng)堿溶液中迅速分解成幾乎無毒的鹽,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,所有裝過AFTB1的瓶子,器皿及AFTB1的殘留液均需過pH 9~10的強(qiáng)堿溶液中,使殘留液分解成無毒的鹽,避免對環(huán)境造成污染。

        3 結(jié)論與討論

        本次實(shí)驗(yàn)得到了花生油中黃曲霉毒素B1較為理想的檢測方法,此方法可推廣到黃曲霉毒素B族和G族的檢測,通過實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛘莆仗岣呙庖哂H和柱回收率的幾個關(guān)鍵點(diǎn),對于其他真菌毒素的檢測提供了借鑒。

        花生油深受廣大消費(fèi)者的喜愛,花生油中含有豐富的不飽和脂肪酸、維生素E等有益成分,經(jīng)常食用可以降低膽固醇,保護(hù)心腦血管[4-5]?;ㄉ碗m然營養(yǎng)價值豐富,但也不能長期食用,世界衛(wèi)生組織、中國糧農(nóng)組織和中國營養(yǎng)學(xué)會等權(quán)威機(jī)構(gòu)研究得出,當(dāng)人體膳食中的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸的平衡比例達(dá)到1∶1∶1時,才是最健康、完美的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)。

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